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NC membrane에서 PVDF membrane으로 바뀐 거 말고는 바뀐게 없고
gel 에 는 protein이 여전히 남아 있고 마커만 깔끔하게 넘어옵니다
실험 중에 찜찜했던 부분은 아이스팩을 넣고 transfer 해도 buffer 에 따뜻할정도로 열이 발생하는 정도인데
current 조건을 사용하려면 좀더 낮춰야하는지 고민이 됩니다
찾아보니 0.8mA/cm^2 넘지 않게 사용하라고 하니 membrane 갯수가 늘어날 수록 current 값을 늘려야 할지 시간을 늘려야할지 고민이 되네요
이리저리 실험할 샘플이 충분치가 않아 기회가 몇번 없어서 western blot 을 하시는 분들과 경험을 공유했으면 합니다.
- western blot
- transfer
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
한민준님의 답변
2021-01-05- 3
biorad 제품인가요? Invitrogen 제품인가요?
두 제품 running condition이 다릅니다.
그리고 PVDF는 Methanol 로 activation을 시켜주어야 하는데 혹시 사용전에 100% methanol에 적신후에 사용하셨나요?
한민준(mjbio) 2021-01-06저는 보통 100v로 transfer하는데요. V로 맞춰서 Transfer를 하게되면 때에 따라서 mA가 다르게 나올수 있습니다. mA가 올라그면 buffer 온도도 놀라갈테구요. 열이 생기면 transfer에는 좋지 않구요..V로 맞추어서 혹시 걸어 보셨나요? 이때 만약 mA가 높아지면 v를 낮추어 주면 됩니다. 시간은 늘리구요..
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김동화님의 답변
2021-01-14- 3
저희 실험실에서 쓰는 방법입니다. -
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김형택님의 답변
2021-01-06- 2
Gel을 코마시블루로 염색했을 때 단백질이 넘어가지 않는 것은 확인하셨나요?
마커가 넘어가는 것을 봤을때는 멤브레인의 문제는 아닌것 같습니다.
제 생각에는 버퍼의 문제인거 같은데 새로 만들어서 다시 해보시는게 어떨까요?
박애리(shara0421) 2021-01-06마커는 넘어간것을 확인했고 젤을 쿠마시블루로 염색해서 단백질만 남아있는 것으로 확인을 했습니다
버퍼 확인도 다했고 위에 답변을 드렸다시피.. 일반적으로 실수날 부분들은 확인 모두 하였습니다 ... -
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김동화님의 답변
2021-01-11- 2
Bio-Rad 시스템을 사용합니다.
버터는 1L 기준으로 800ml H2O, 3.03g Trisbase, 14.4g Glycine, 200 ml Methanol 입니다.
개인적으로 Transfer을 cold room에서 작은 젤 기준으로 25-35 V로 밤새 합니다. 다음날 아침에 확인하고 실험을 합니다.
박애리(shara0421) 2021-01-12그러면 젤에 남아있는것이 없이 깨끗하게 넘어오는 편인가요 ? 제가 고민하는 것은 10~15% 젤을 만들어서 100kDa부터 17Da 까지 band를 봐야해서 gel에서 protein이 모두 membrane으로 단백질이 넘어왔으면 좋겠어서요 ㅜㅠ
김동화(wesley3317) 2021-01-12개인적으로 100% 라고 생각을 합니다.
주로 12% 젤을 사용하는데 170, 130 kDa 마커도 남아있는것 없이 깨끗합니다.
시간도 중요하지만 샘플도 중요하잖아요.
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조수호님의 답변
2022-01-07- 0
윗 분들의 말씀과 추가해서 저희 실험실은 질문자님과 membrane 등 실험 조건 동일한 상태에서 10,12% gel의 경우 250mA, 120min으로 합니다. 대신 저희는 아이스를 통해 온도가 올라가는 것을 최대한 방지하려합니다.
biorad 제품이고 PVDF는 methanol 로 activation 당연히 했습니다 ㅎㅎ100% 에 적신후에 Transfer buffer에 충분히 buffer change 되게 했는데 일반적인 실수날 부분들은 문제없음을 모두 체크했습니다