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Mouse tisse에서 IHC를 진행하고 있습니다.
한 slide에 paraffin section이 2개 있고 하나는 target protein antibody, 하나는 Isotype control IgG를 incubation했습니다.
동일한 slide위에 있으니 defaraffinization, washing, blocking, 1차 및 2차 항체 incubation, DAB 발색 등등
모두 동일하게 진행되었습니다.
Target protein antibody는 rabbit antibody고 Isotype control IgG도 rabbit IgG입니다.
2차 항체는 당연히 anti-rabbit-HRP를 사용하구요.
그런데 Target protein antibody를 incubation한 tissue에선 staining이 하나도 되지 않고 깔끔한데
Isotype control IgG를 incuabtion한 tissue에선 갈색으로 staining되었습니다.
1차 항체를 바꿔서 사용하지도 않았는데 도저히 이해가 되질 않아 조언을 구하고자 질문 올렸습니다.
- IHC
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
강민국님의 답변
2024-11-21- 0
Control로 사용하신 항체는 Rabbit에서 뽑은 항체입니다.
Target을 detection하는 antibody는 해당 단백질만을 잡도록 디자인되었으며 정제까지 완료된 것입니다.
반면에 Rabbit normal IgG의 경우는 Rabbit이 가지고 있는 대부분의 항체들이 포함되어 있을 것입니다.
Target antibody의 경우는 Target을 잡느냐 못잡느냐의 문제이지만 Rabbit IgG의 경우 샘플이 Rabbit 체내에 있느냐 없느냐의 문제입니다.
당연히 Mouse 단백질들은 Rabbit에 없으니 IgG들이 Mouse 조직에 덕지덕지 붙을 것으로 예상됩니다.
아마도 이러한 이유로 Target은 깨끗하지만 control IgG에서는 발색이 일어난 것으로 보입니다.