지방세포의 역분화
2018-12-06
org.kosen.entty.User@711347dc
장현준(hjang)
1. 개요
일반적으로 지방세포 (adipocyte)는 최종적으로 분화가 완료된 세포라 생각돼 왔다. 하지만 최근의 연구 결과들은 특정 환경에서 지방세포가 높은 가소성 (plasticity)를 가지며 역분화 (dedifferentiation) 한다는 것을 보여주고 있다. 역분화한 지방세포 (dedifferentiated fat, DFAT)는 줄기세포 (stem cell) 연구를 위한 새로운 세포 공급원이 될 수 있는 등 의학적 활용등 여러 분야에서 그 활용 가능성이 부각되고 있다. 역분화 지방세포는 세포기반 치료에 사용 했을 때 virus와 같은 외부요인을 사용할 필요가 없어 안전하고 확보가 쉬우며 전분화능 (pluripotency)을 가진다는 점에서 많은 장점을 가지고 있다. 사람의 역분화 지방세포는 지방조직에서 추출한 줄기세포보다도 조골세포 (osteoblast)로 분화하는 능력이 높게 확인 되었다[3]. 이외에도 혈관 내피세포[4], 심근세포[5], 심경세포[6], 연골세포[7], 골격근세포[8], 평활근세포[9]로도 분화가 가능함이 보고 되었다. 하지만 아직은 역분화 지방세포 연구에는 다른 세포의 오염 (purity)과 같은 극복해야 할 문제들이 많이 존재하며 표현형의 특성, 역분화 기전에 대한 연구가 필요하다.
2. 주요 내용
2.1 역분화 지방세포의 획득 방법
역분화 지방세포는 성숙한 지방세포에서 만들어지며 1970년대 이후 전통적인 천장 배양 (ceiling culture) 방법을 통해 사람과 생쥐, 돼지 등 여러 종의 지방에서 유래한 지방 방울을 가지는 지방세포가 다분화능 (multipotent)을 가진 줄기세포로 변화 될 수 있다는 증거들이 제시 되었다. 역분화 지방세포를 분리하는데 있어 가장 큰 문제 중 하나는 세포의 순수성이다. 지방세포가 지방조직에 존재하는 유일한 세포가 아니기 때문에 역분화 지방세포를 추출하는 과정에서 적은 수의 지방전구세포, 섬유아세포, 줄기세포 등이 지방세포와 섞여서 배양될 수 있다[10-12]. 역분화 지방세포가 만들어 지는데 5~7일이 소요되기 때문에 적은 양의 세포가 오염이 되어도 세포분열을 통해 그 수가 늘어 불균등성 (inhomogeneity)를 가져올 수 있다. 때문에 현미경을 이용한 형태 확인과 성숙한 지방세포의 표지인자인 perilpin과 Nile red를 이용하여 염색을 통해 순수성을 평가하고 있다. 한편 다른 세포의 오염을 막기 위해 세포가 플라스크에 부착하는 시간 차이를 이용하여 천장 배양 1~2 일 후 플라스크를 옮겨 다시 천장 배양하여 지방세포만 얻는 방법을 이용한다. 또는 천장 배양하여 붙은 세포들을 트립신 (trypsin)을 이용하여 분리 후 원심분리하여 지방세포와 다른세포를 분리 후 다시 천장배양 하는 방법이 이용되고 있다. 하지만 이런 방법으로도 다른 세포의 오염을 완전히 배재하긴 어려움이 있어 다른 방법들이 개발 중에 있다.
![텍스트 상자: 천장 배양
<br/>
<br/>세포질에 커다란 지방 방울을 지니는 지방세포는 배양 시 배양액 위로 떠오르며 서로 뭉치게 되고 각 세포들이 배양액에 동일하게 충분히 접촉되지 못해 세포 용해 (lysis)가 나타나게 된다. 이를 극복하기 위해 지방 조직에서 지방 세포를 추출 시 배양 플라스크에 배양액을 가득 채워 떠오르는 지방 조직 단편들이 윗면에 닿을 수 있도록 하고 세포들이 윗면에 부착이 되면 플라스크를 뒤집어서 정상적인 배양 조건에서도 바닥에 붙어 있을 수 있도록 하는 배양 방법이다. 이러한 배양법을 통해 성숙한 지방세포의 일부가 분열한다는 것 확인 하였다[1, 2].
<br/>](file:///C:\Users\Hyun-Jun\AppData\Local\Temp\msohtmlclip1\01\clip_image002.png)
천장 배양 방법은 역분화 지방세포를 얻기 위해 가장 많이 사용되는 방법이지만 플라스크 배양을 위해 많은 수의 세포가 필요하고 배양 조건을 조절하는데 제약이 많아 여러 조건 변화에서 대사적 분자적 변화들을 분석하는데 어려움이 있다. 때문에 이를 극복하기 위한 여러 배양법이 개발되고 있다. 그 중 한 방법은 물에 뜨는 유리조각을 이용하여 여기세 지방세포가 부착하도록 하는 방법이 있다[2]. 다른 방법은 70 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 일반적인 배양접시에서 지방세포를 배양하면서 역분화 하여 필터를 통과 후 가라앉는 역분화 지방세포를 모으는 방법이 있다[13]. 또 다른 방법으로는 6 well 플레이트에 지방세포와 미디어를 채우고 각 well을 유리 슬라이드로 덮어 유리 슬라이드에 역분화 지방세포가 생기도록 하는 방법이 제시 되었다[14].
2.2 역분화 지방세포의 표현형적 특징
역분화 지방세포의 다분화능은 여러 줄기세포 마커의 발현과 여러세포로 분화를 시킴으로써 확인이 된다. 천장 배양 동안에 역분화 지방세포는 LPL, LEP, GLUT4, PPARG와 같은 지방세포 특이적인 유전자의 발현이 감소하고 대신 Oct4, Sox2, cMyc, Klf4, nanog와 같은 여러 줄기세포 특이적인 유전자를 발현한다. 또한 말단소체복원효소 (telomerase)의 활성이 지방유래 줄기세포보다 높게 나타나게 된다[13].
역분화 지방세포와 지방유래 줄기 세포는 매우 유사한 유전자 발현 양상을 보인다. 이 두 세포는 CD13, CD29, CD44, CD90, CD105, HLA-A, B, C를 발현하고 있으며 CD56을 발현하지 않는다. 반면에 역분화 지방세포에서는 지방유래 줄기 세포와는 달리 αSMA, CD140b, CD106, CD31, CD45, CD11b, CD34를 발현하지 않는다 (CD140b의 경우 발현한다는 보고도 있다.) [15-17].
2.3 역분화 지방세포의 역분화 기전
성숙한 지방세포는 천장배양을 통해 역분화 지방세포가 되면서 본래 가지고 있던 지방을 잃게 된다. 천장 배양 10일 후에 현미경상으로 지방 방울 (lipid droplets)이 작은 방울들도 부서지고 둥그런 외형을 잃고 섬유아세포와 유사한 형태를 띄게 된다. 일부 보고에서는 역분화 과정에서 성숙한 지방세포가 비대칭적인 (asymmertrical) 분열을 하고 후에 역분화 지방세포가 되는 지방세포가 아닌 딸세포를 만들어 낸다고 보고하였다[15]. 천장 배양 7일 이후에 50 %의 지방세포가 BrdU 체내화 (incorporation)을 보이며, 40 % 정도가 섬유아세포와 유사한 형태를 가짐을 보이면서 지방세포가 DNA를 합성할 수 있는 능력이 있음을 보였다. 또한 Hoechst 33342를 이용하여 지방세포의 핵이 비대칭적으로 나뉘는 것을 보여주었다. 이처럼 현상적으로 역분화 지방세포가 만들어 지는 과정이 제시되었지만 그 세부 기전에 대해서는 많은 연구가 이루어져 있지 않다.
다만 다른 최종적으로 분화된 세포가 역분화 하는 과정을 통해 작용 기전을 예상해 볼 수 있다. 포유류의 분화된 세포가 역분화 하는 환경에 대해서는 일부 밝혀져 있고 특정 외부 자극 또는 유전적 조절을 통해 이루어진다고 보고가 되고 있다. 생쥐의 근육대롱세포(myotube)의 경우 영원류(newts)의 재생중인 다리로 부터의 추출물을 처리한 경우 역분화가 이루어짐이 보고되었다[18]. 슈반세포 (schwann cell)의 경우 Ras/Raf/ERK 신호가 활성화 되면서 다시 분열하는 특성을 띄게 된다고 보고 되었다[19]. Ras의 과발현을 통해 Raf/ERK를 통한 슈반세포의 역분화를 확인하였으며, 신경 돌기의 신호에 반응하여 수초 (myelination)를 형성하기 위하여 Raf/ERK 신호를 통해 슈반세포의 역분화가 이루어 진다고 보고하였다. 평활근세포[20]와 연골세포[21]의 경우 저산소 (hypoxia)에 의해 역분화가 이루어진다. 지방세포를 천장 배양 할 경우 지방세포 또한 저산소 상태를 겪게 되기 때문에 저산소가 지방세포의 역분화를 유발하는 요인으로서 제시가 되었다. 하지만 최근에 연구에서 저산소가 나타나지 않는 환경에서 역분화 지방세포를 획득하면서 이 가설에 반대하는 결과를 제시하였다[14]. 이밖에 고농도의 혈청 배양 조건과 TGF-β, Notch, Wnt 등의 인자들이 지방 역분화에 관여할 것으로 제시되고 있으나 실제 세부적인 기전 등이 제시되고 있지는 않다[22, 23].
2.4 유방 지방세포의 주기적 역분화
지방세포는 생쥐 (mouse)의 유선 (mammary gland)조직의 90% 가까이를 차지하고 있다. 하지만 임신과 수유 중에는 지방세포의 수가 현저히 감소하는 것을 관찰 할 수 있다. 이 시기에 유선의 상피조직이 빠르게 확장하면서 모유를 생성하는 꽈리 구조 (milk producing alveolar structure)를 이루게 된다. 이유기에 이르러서 분비성 상피세포는 세포 사멸 (apoptosis)을 겪게 되고 지방세포를 재생산하기 위한 지방분화가 동시에 일어나게 된다. 전자현미경과 whey acid protein (WAP) 프로모터 (promoter)와 fatty acid binding protein 4 (FABP4) 프로모터를 이용하여 분비성 상피세포와 지방세포의 혈통을 추적하는 유전자이식 (transgenic) 생쥐를 이용한 연구[24, 25]에서 유방의 지방세포가 꽈리 상피세포로 교차분화 (transdifferentiation)이 일어 날 수 있으며, 역으로 꽈리 상피세포가 지방세포로 교차분화 할 수 있다는 증거가 제시 되었다. 이와 유사한 실험방법을 이용하여 꽈리 상피세포가 갈색 지방세포 (brown adipocyte)로 교차분화 할 수 있음이 제시되었다[26].
최신의 연구에서 AdipoChaser-LacZ 생쥐를 이용하여 수유기 (lactation)에 완전히 분화 된 지방세포가 지방분화 전의 줄기세포와 유사한 세포로 역분화 한다는 것이 밝혀졌다[27]. Adiponectin과 함께 LacZ를 발현하는 세포를 doxycycline로 생식과정 (reproduction)의 각 시기별로 활성화 하여 비가역적으로 표지 함으로써 수유기에 상당히 많은 수의 LacZ 표지 된 세포들이 지방세포의 모습을 하지 않음을 보여주었다. 이들 세포는 일반적인 지방세포보다 작았으며 지방 방울을 가지고 있지 않으며 지방 전구세포의 특징인 PDGFRα를 발현하였다. 또한 기존의 연구 결과들과는 달리 분비성 상피 구조에서는 LacZ가 표지 된 세포를 확인하지 못하였으며 꽈리 상피세포와 지방세포간에 교차분화가 일어나지 않음을 제시하였다. 기존의 연구에서는 지방세포를 표지하기 위해 FABP4의 프로모터를 사용하였고 최근의 연구에서는 adiponectin의 프로모터를 사용했다는 차이가 있으며 이에 의해 표지된 세포들 간에 차이가 서로 다른 양상의 결과를 나타냈을 수 있다. 또한 이 역분화된 세포는 유선의 퇴축기 (involution)동안 다시 지방세포로 분화가 되며 임신을 반복하는 과정에서 이러한 역분화와 재분화의 과정을 반복하게 되는데, 이렇게 LacZ에 표지된 세포들이 반복된 임신에서도 상당수 유지되는 것을 보여줌으로써 퇴축기에 나타나는 지방세포가 de novo adipogenesis보다는 기존 지방세포의 역분화와 재분화에 의한 것임을 보여주었다. 아직까지 임신과 수유기, 퇴축기에서 반복되는 역분화와 재분화를 설명해주는 작용기전은 밝혀지지 않았으며, 이들 역분화된 세포가 실제 지방 전구세포와 얼마나 유사한지? 다른 세포로의 분화가 가능한지? 이러한 역분화와 재분화가 임신주기에서 다른 기관에서도 발생하는지? 등 많은 부분이 밝혀져야 할 과제로 남아있다.
2.5 피부 지방세포의 역분화
최근의 연구에서 섬유화된 피부에 존재하는 근섬유모세포 (myofibroblast)가 adiponectin을 발현하는 전구세포에서 유래한다는 것이 밝혀짐으로써 근섬유모세포가 지방세포가 근섬유모세포의 전구세포가 될 수 있음이 제시되었다[28]. 피부경화증은 근섬유모세포의 축적과 함께 이루어지는데 최근까지 그 기원이 명확하지 않았었다. 피부경화증의 증상 중 하나로서 피부 내부의 (intradermal) 지방 조직의 감소가 나타나는데 지방세포가 근섬유모세포로 변화하면서 지방세포가 감사하고 근섬유모세포가 증가하게 됨을 제시하였다. 블레오마이신 (bleomycin)으러 처리하여 섬유화를 유도하면 지방세포 특이적인 유전자의 발현이 감소하고 섬유화 (fibrogenic)와 관련된 유전자의 발현이 증가하게 된다. 지방세포에 TGF-β를 처리함으로써 이러한 변화가 나타남을 확인 하였다. 지방 특이적인 adiponectin의 프로모터를 이용한 Cre와 리포터 마우스를 이용하여 섬유화에서 만들어지는 근섬유모세포가 adiponectin을 발현하는 시기를 거쳤음을 보여줌으로써 그 기원이 지방세포임을 보였다. 하지만 이 연구에서는 지방세포가 근섬유모세포로 바뀜을 보여줌으로써 교차분화를 보여줌으로써 지방세포가 역분화 단계를 거치는지를 직접적으로 제시해 주지는 않는다. 때문에 피부경화에서 지방세포가 역분화 하는지에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
3. 결론
지방의 역분화는 1970년대 이후 연구가 되고 있지만 아직 그 작용기전에 대해서는 모르는 부분이 많다. 천장 배양이라는 제한된 배양법으로 연구가 진행되기 때문에 이를 극복하기 위한 새로운 배양법들이 계속 제시되고 있으며 이를 통해 분자적, 대사적 변화를 분석하는 연구들이 이루어 지고 있다. 이전에는 지방의 역분화가 실제 어떤 생리적 의미를 가지는지 밝혀지지 않았었지만 최근의 연구를 통해 피부와 유선조직에서 지방세포가 다른 세포로 변하면서 기능을 한다 것이 보고되어 있어 그 생리적 기능이 조금씩 밝혀지고 있는 추세이다. 하지만 아직까지 어떻게 지방의 역분화가 이루어지는지 명확한 기전을 제시한 연구는 없다. 지방의 역분화는 성체로부터 쉽게 줄기세포를 얻을 수 있다는 점에서 재생의학에서도 많은 주목을 받고 있고 실제 활용가치가 큰 분야이다. 때문에 실제 활용을 위한 안전성 확보와 임상적 이용을 위해서 지방의 역분화에 대한 더 많은 연구가 이루어져야 할 것이다.
References
1. Sugihara, H., et al., A simple culture method of fat cells from mature fat tissue fragments. J Lipid Res, 1989. 30(12): p. 1987-95.
2. Zhang, H.H., et al., Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol, 2000. 164(2): p. 119-28.
3. Kishimoto, N., et al., The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig, 2014. 18(8): p. 1893-901.
4. Jumabay, M., et al., Endothelial differentiation in multipotent cells derived from mouse and human white mature adipocytes. J Mol Cell Cardiol, 2012. 53(6): p. 790-800.
5. Long, A., et al., Takayasu's disease: diagnostic and therapeutic value of subclavian artery biopsy. Ann Vasc Surg, 1990. 4(2): p. 151-5.
6. Ohta, Y., et al., Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant, 2008. 17(8): p. 877-86.
7. Erickson, G.R., et al., Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 290(2): p. 763-9.
8. Bacou, F., et al., Transplantation of adipose tissue-derived stromal cells increases mass and functional capacity of damaged skeletal muscle. Cell Transplant, 2004. 13(2): p. 103-11.
9. Di Rocco, G., et al., Myogenic potential of adipose-tissue-derived cells. J Cell Sci, 2006. 119(Pt 14): p. 2945-52.
10. Tholpady, S.S., et al., The cellular plasticity of human adipocytes. Ann Plast Surg, 2005. 54(6): p. 651-6.
11. Cawthorn, W.P., E.L. Scheller, and O.A. MacDougald, Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. J Lipid Res, 2012. 53(2): p. 227-46.
12. Fernyhough, M.E., J.L. Vierck, and M.V. Dodson, Assessing a non-traditional view of adipogenesis: adipocyte dedifferentiation--mountains or molehills? Cells Tissues Organs, 2006. 182(3-4): p. 226-8.
13. Jumabay, M., et al., Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med, 2014. 3(2): p. 161-71.
14. Cote, J.A., et al., Role of the TGF-beta pathway in dedifferentiation of human mature adipocytes. FEBS Open Bio, 2017. 7(8): p. 1092-1101.
15. Matsumoto, T., et al., Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol, 2008. 215(1): p. 210-22.
16. Katz, A.J., et al., Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells, 2005. 23(3): p. 412-23.
17. Schaffler, A. and C. Buchler, Concise review: adipose tissue-derived stromal cells--basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells, 2007. 25(4): p. 818-27.
18. McGann, C.J., S.J. Odelberg, and M.T. Keating, Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(24): p. 13699-704.
19. Harrisingh, M.C., et al., The Ras/Raf/ERK signalling pathway drives Schwann cell dedifferentiation. EMBO J, 2004. 23(15): p. 3061-71.
20. Aitken, K.J., et al., Mammalian target of rapamycin (mTOR) induces proliferation and de-differentiation responses to three coordinate pathophysiologic stimuli (mechanical strain, hypoxia, and extracellular matrix remodeling) in rat bladder smooth muscle. Am J Pathol, 2010. 176(1): p. 304-19.
21. Lafont, J.E., Lack of oxygen in articular cartilage: consequences for chondrocyte biology. Int J Exp Pathol, 2010. 91(2): p. 99-106.
22. Bi, P., et al., Notch activation drives adipocyte dedifferentiation and tumorigenic transformation in mice. J Exp Med, 2016. 213(10): p. 2019-37.
23. Chirumbolo, S. and G. Bjorklund, Can Wnt5a and Wnt non-canonical pathways really mediate adipocyte de-differentiation in a tumour microenvironment? Eur J Cancer, 2016. 64: p. 96-100.
24. Giordano, A., et al., MECHANISMS IN ENDOCRINOLOGY White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. European Journal of Endocrinology, 2014. 170(5): p. R159-R171.
25. Morroni, M., et al., Reversible transdifferentiation of secretory epithelial cells into adipocytes in the mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. 101(48): p. 16801-16806.
26. Giordano, A., et al., Mammary alveolar epithelial cells convert to brown adipocytes in post-lactating mice. J Cell Physiol, 2017. 232(11): p. 2923-2928.
27. Wang, Q.A., et al., Reversible De-differentiation of Mature White Adipocytes into Preadipocyte-like Precursors during Lactation. Cell Metab, 2018. 28(2): p. 282-288 e3.
28. Marangoni, R.G., et al., Myofibroblasts in murine cutaneous fibrosis originate from adiponectin-positive intradermal progenitors. Arthritis Rheumatol, 2015. 67(4): p. 1062-73.
일반적으로 지방세포 (adipocyte)는 최종적으로 분화가 완료된 세포라 생각돼 왔다. 하지만 최근의 연구 결과들은 특정 환경에서 지방세포가 높은 가소성 (plasticity)를 가지며 역분화 (dedifferentiation) 한다는 것을 보여주고 있다. 역분화한 지방세포 (dedifferentiated fat, DFAT)는 줄기세포 (stem cell) 연구를 위한 새로운 세포 공급원이 될 수 있는 등 의학적 활용등 여러 분야에서 그 활용 가능성이 부각되고 있다. 역분화 지방세포는 세포기반 치료에 사용 했을 때 virus와 같은 외부요인을 사용할 필요가 없어 안전하고 확보가 쉬우며 전분화능 (pluripotency)을 가진다는 점에서 많은 장점을 가지고 있다. 사람의 역분화 지방세포는 지방조직에서 추출한 줄기세포보다도 조골세포 (osteoblast)로 분화하는 능력이 높게 확인 되었다[3]. 이외에도 혈관 내피세포[4], 심근세포[5], 심경세포[6], 연골세포[7], 골격근세포[8], 평활근세포[9]로도 분화가 가능함이 보고 되었다. 하지만 아직은 역분화 지방세포 연구에는 다른 세포의 오염 (purity)과 같은 극복해야 할 문제들이 많이 존재하며 표현형의 특성, 역분화 기전에 대한 연구가 필요하다.
2. 주요 내용
2.1 역분화 지방세포의 획득 방법
역분화 지방세포는 성숙한 지방세포에서 만들어지며 1970년대 이후 전통적인 천장 배양 (ceiling culture) 방법을 통해 사람과 생쥐, 돼지 등 여러 종의 지방에서 유래한 지방 방울을 가지는 지방세포가 다분화능 (multipotent)을 가진 줄기세포로 변화 될 수 있다는 증거들이 제시 되었다. 역분화 지방세포를 분리하는데 있어 가장 큰 문제 중 하나는 세포의 순수성이다. 지방세포가 지방조직에 존재하는 유일한 세포가 아니기 때문에 역분화 지방세포를 추출하는 과정에서 적은 수의 지방전구세포, 섬유아세포, 줄기세포 등이 지방세포와 섞여서 배양될 수 있다[10-12]. 역분화 지방세포가 만들어 지는데 5~7일이 소요되기 때문에 적은 양의 세포가 오염이 되어도 세포분열을 통해 그 수가 늘어 불균등성 (inhomogeneity)를 가져올 수 있다. 때문에 현미경을 이용한 형태 확인과 성숙한 지방세포의 표지인자인 perilpin과 Nile red를 이용하여 염색을 통해 순수성을 평가하고 있다. 한편 다른 세포의 오염을 막기 위해 세포가 플라스크에 부착하는 시간 차이를 이용하여 천장 배양 1~2 일 후 플라스크를 옮겨 다시 천장 배양하여 지방세포만 얻는 방법을 이용한다. 또는 천장 배양하여 붙은 세포들을 트립신 (trypsin)을 이용하여 분리 후 원심분리하여 지방세포와 다른세포를 분리 후 다시 천장배양 하는 방법이 이용되고 있다. 하지만 이런 방법으로도 다른 세포의 오염을 완전히 배재하긴 어려움이 있어 다른 방법들이 개발 중에 있다.
|
천장 배양
 세포질에 커다란 지방 방울을 지니는 지방세포는 배양 시 배양액 위로 떠오르며 서로 뭉치게 되고 각 세포들이 배양액에 동일하게 충분히 접촉되지 못해 세포 용해 (lysis)가 나타나게 된다. 이를 극복하기 위해 지방 조직에서 지방 세포를 추출 시 배양 플라스크에 배양액을 가득 채워 떠오르는 지방 조직 단편들이 윗면에 닿을 수 있도록 하고 세포들이 윗면에 부착이 되면 플라스크를 뒤집어서 정상적인 배양 조건에서도 바닥에 붙어 있을 수 있도록 하는 배양 방법이다. 이러한 배양법을 통해 성숙한 지방세포의 일부가 분열한다는 것 확인 하였다[1, 2]. |
천장 배양 방법은 역분화 지방세포를 얻기 위해 가장 많이 사용되는 방법이지만 플라스크 배양을 위해 많은 수의 세포가 필요하고 배양 조건을 조절하는데 제약이 많아 여러 조건 변화에서 대사적 분자적 변화들을 분석하는데 어려움이 있다. 때문에 이를 극복하기 위한 여러 배양법이 개발되고 있다. 그 중 한 방법은 물에 뜨는 유리조각을 이용하여 여기세 지방세포가 부착하도록 하는 방법이 있다[2]. 다른 방법은 70 μm의 구멍을 가지는 필터를 이용하여 일반적인 배양접시에서 지방세포를 배양하면서 역분화 하여 필터를 통과 후 가라앉는 역분화 지방세포를 모으는 방법이 있다[13]. 또 다른 방법으로는 6 well 플레이트에 지방세포와 미디어를 채우고 각 well을 유리 슬라이드로 덮어 유리 슬라이드에 역분화 지방세포가 생기도록 하는 방법이 제시 되었다[14]. 2.2 역분화 지방세포의 표현형적 특징
역분화 지방세포의 다분화능은 여러 줄기세포 마커의 발현과 여러세포로 분화를 시킴으로써 확인이 된다. 천장 배양 동안에 역분화 지방세포는 LPL, LEP, GLUT4, PPARG와 같은 지방세포 특이적인 유전자의 발현이 감소하고 대신 Oct4, Sox2, cMyc, Klf4, nanog와 같은 여러 줄기세포 특이적인 유전자를 발현한다. 또한 말단소체복원효소 (telomerase)의 활성이 지방유래 줄기세포보다 높게 나타나게 된다[13].
역분화 지방세포와 지방유래 줄기 세포는 매우 유사한 유전자 발현 양상을 보인다. 이 두 세포는 CD13, CD29, CD44, CD90, CD105, HLA-A, B, C를 발현하고 있으며 CD56을 발현하지 않는다. 반면에 역분화 지방세포에서는 지방유래 줄기 세포와는 달리 αSMA, CD140b, CD106, CD31, CD45, CD11b, CD34를 발현하지 않는다 (CD140b의 경우 발현한다는 보고도 있다.) [15-17].
2.3 역분화 지방세포의 역분화 기전
성숙한 지방세포는 천장배양을 통해 역분화 지방세포가 되면서 본래 가지고 있던 지방을 잃게 된다. 천장 배양 10일 후에 현미경상으로 지방 방울 (lipid droplets)이 작은 방울들도 부서지고 둥그런 외형을 잃고 섬유아세포와 유사한 형태를 띄게 된다. 일부 보고에서는 역분화 과정에서 성숙한 지방세포가 비대칭적인 (asymmertrical) 분열을 하고 후에 역분화 지방세포가 되는 지방세포가 아닌 딸세포를 만들어 낸다고 보고하였다[15]. 천장 배양 7일 이후에 50 %의 지방세포가 BrdU 체내화 (incorporation)을 보이며, 40 % 정도가 섬유아세포와 유사한 형태를 가짐을 보이면서 지방세포가 DNA를 합성할 수 있는 능력이 있음을 보였다. 또한 Hoechst 33342를 이용하여 지방세포의 핵이 비대칭적으로 나뉘는 것을 보여주었다. 이처럼 현상적으로 역분화 지방세포가 만들어 지는 과정이 제시되었지만 그 세부 기전에 대해서는 많은 연구가 이루어져 있지 않다.
다만 다른 최종적으로 분화된 세포가 역분화 하는 과정을 통해 작용 기전을 예상해 볼 수 있다. 포유류의 분화된 세포가 역분화 하는 환경에 대해서는 일부 밝혀져 있고 특정 외부 자극 또는 유전적 조절을 통해 이루어진다고 보고가 되고 있다. 생쥐의 근육대롱세포(myotube)의 경우 영원류(newts)의 재생중인 다리로 부터의 추출물을 처리한 경우 역분화가 이루어짐이 보고되었다[18]. 슈반세포 (schwann cell)의 경우 Ras/Raf/ERK 신호가 활성화 되면서 다시 분열하는 특성을 띄게 된다고 보고 되었다[19]. Ras의 과발현을 통해 Raf/ERK를 통한 슈반세포의 역분화를 확인하였으며, 신경 돌기의 신호에 반응하여 수초 (myelination)를 형성하기 위하여 Raf/ERK 신호를 통해 슈반세포의 역분화가 이루어 진다고 보고하였다. 평활근세포[20]와 연골세포[21]의 경우 저산소 (hypoxia)에 의해 역분화가 이루어진다. 지방세포를 천장 배양 할 경우 지방세포 또한 저산소 상태를 겪게 되기 때문에 저산소가 지방세포의 역분화를 유발하는 요인으로서 제시가 되었다. 하지만 최근에 연구에서 저산소가 나타나지 않는 환경에서 역분화 지방세포를 획득하면서 이 가설에 반대하는 결과를 제시하였다[14]. 이밖에 고농도의 혈청 배양 조건과 TGF-β, Notch, Wnt 등의 인자들이 지방 역분화에 관여할 것으로 제시되고 있으나 실제 세부적인 기전 등이 제시되고 있지는 않다[22, 23].
2.4 유방 지방세포의 주기적 역분화
지방세포는 생쥐 (mouse)의 유선 (mammary gland)조직의 90% 가까이를 차지하고 있다. 하지만 임신과 수유 중에는 지방세포의 수가 현저히 감소하는 것을 관찰 할 수 있다. 이 시기에 유선의 상피조직이 빠르게 확장하면서 모유를 생성하는 꽈리 구조 (milk producing alveolar structure)를 이루게 된다. 이유기에 이르러서 분비성 상피세포는 세포 사멸 (apoptosis)을 겪게 되고 지방세포를 재생산하기 위한 지방분화가 동시에 일어나게 된다. 전자현미경과 whey acid protein (WAP) 프로모터 (promoter)와 fatty acid binding protein 4 (FABP4) 프로모터를 이용하여 분비성 상피세포와 지방세포의 혈통을 추적하는 유전자이식 (transgenic) 생쥐를 이용한 연구[24, 25]에서 유방의 지방세포가 꽈리 상피세포로 교차분화 (transdifferentiation)이 일어 날 수 있으며, 역으로 꽈리 상피세포가 지방세포로 교차분화 할 수 있다는 증거가 제시 되었다. 이와 유사한 실험방법을 이용하여 꽈리 상피세포가 갈색 지방세포 (brown adipocyte)로 교차분화 할 수 있음이 제시되었다[26].
최신의 연구에서 AdipoChaser-LacZ 생쥐를 이용하여 수유기 (lactation)에 완전히 분화 된 지방세포가 지방분화 전의 줄기세포와 유사한 세포로 역분화 한다는 것이 밝혀졌다[27]. Adiponectin과 함께 LacZ를 발현하는 세포를 doxycycline로 생식과정 (reproduction)의 각 시기별로 활성화 하여 비가역적으로 표지 함으로써 수유기에 상당히 많은 수의 LacZ 표지 된 세포들이 지방세포의 모습을 하지 않음을 보여주었다. 이들 세포는 일반적인 지방세포보다 작았으며 지방 방울을 가지고 있지 않으며 지방 전구세포의 특징인 PDGFRα를 발현하였다. 또한 기존의 연구 결과들과는 달리 분비성 상피 구조에서는 LacZ가 표지 된 세포를 확인하지 못하였으며 꽈리 상피세포와 지방세포간에 교차분화가 일어나지 않음을 제시하였다. 기존의 연구에서는 지방세포를 표지하기 위해 FABP4의 프로모터를 사용하였고 최근의 연구에서는 adiponectin의 프로모터를 사용했다는 차이가 있으며 이에 의해 표지된 세포들 간에 차이가 서로 다른 양상의 결과를 나타냈을 수 있다. 또한 이 역분화된 세포는 유선의 퇴축기 (involution)동안 다시 지방세포로 분화가 되며 임신을 반복하는 과정에서 이러한 역분화와 재분화의 과정을 반복하게 되는데, 이렇게 LacZ에 표지된 세포들이 반복된 임신에서도 상당수 유지되는 것을 보여줌으로써 퇴축기에 나타나는 지방세포가 de novo adipogenesis보다는 기존 지방세포의 역분화와 재분화에 의한 것임을 보여주었다. 아직까지 임신과 수유기, 퇴축기에서 반복되는 역분화와 재분화를 설명해주는 작용기전은 밝혀지지 않았으며, 이들 역분화된 세포가 실제 지방 전구세포와 얼마나 유사한지? 다른 세포로의 분화가 가능한지? 이러한 역분화와 재분화가 임신주기에서 다른 기관에서도 발생하는지? 등 많은 부분이 밝혀져야 할 과제로 남아있다.
2.5 피부 지방세포의 역분화
최근의 연구에서 섬유화된 피부에 존재하는 근섬유모세포 (myofibroblast)가 adiponectin을 발현하는 전구세포에서 유래한다는 것이 밝혀짐으로써 근섬유모세포가 지방세포가 근섬유모세포의 전구세포가 될 수 있음이 제시되었다[28]. 피부경화증은 근섬유모세포의 축적과 함께 이루어지는데 최근까지 그 기원이 명확하지 않았었다. 피부경화증의 증상 중 하나로서 피부 내부의 (intradermal) 지방 조직의 감소가 나타나는데 지방세포가 근섬유모세포로 변화하면서 지방세포가 감사하고 근섬유모세포가 증가하게 됨을 제시하였다. 블레오마이신 (bleomycin)으러 처리하여 섬유화를 유도하면 지방세포 특이적인 유전자의 발현이 감소하고 섬유화 (fibrogenic)와 관련된 유전자의 발현이 증가하게 된다. 지방세포에 TGF-β를 처리함으로써 이러한 변화가 나타남을 확인 하였다. 지방 특이적인 adiponectin의 프로모터를 이용한 Cre와 리포터 마우스를 이용하여 섬유화에서 만들어지는 근섬유모세포가 adiponectin을 발현하는 시기를 거쳤음을 보여줌으로써 그 기원이 지방세포임을 보였다. 하지만 이 연구에서는 지방세포가 근섬유모세포로 바뀜을 보여줌으로써 교차분화를 보여줌으로써 지방세포가 역분화 단계를 거치는지를 직접적으로 제시해 주지는 않는다. 때문에 피부경화에서 지방세포가 역분화 하는지에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
3. 결론
지방의 역분화는 1970년대 이후 연구가 되고 있지만 아직 그 작용기전에 대해서는 모르는 부분이 많다. 천장 배양이라는 제한된 배양법으로 연구가 진행되기 때문에 이를 극복하기 위한 새로운 배양법들이 계속 제시되고 있으며 이를 통해 분자적, 대사적 변화를 분석하는 연구들이 이루어 지고 있다. 이전에는 지방의 역분화가 실제 어떤 생리적 의미를 가지는지 밝혀지지 않았었지만 최근의 연구를 통해 피부와 유선조직에서 지방세포가 다른 세포로 변하면서 기능을 한다 것이 보고되어 있어 그 생리적 기능이 조금씩 밝혀지고 있는 추세이다. 하지만 아직까지 어떻게 지방의 역분화가 이루어지는지 명확한 기전을 제시한 연구는 없다. 지방의 역분화는 성체로부터 쉽게 줄기세포를 얻을 수 있다는 점에서 재생의학에서도 많은 주목을 받고 있고 실제 활용가치가 큰 분야이다. 때문에 실제 활용을 위한 안전성 확보와 임상적 이용을 위해서 지방의 역분화에 대한 더 많은 연구가 이루어져야 할 것이다.
References
1. Sugihara, H., et al., A simple culture method of fat cells from mature fat tissue fragments. J Lipid Res, 1989. 30(12): p. 1987-95.
2. Zhang, H.H., et al., Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol, 2000. 164(2): p. 119-28.
3. Kishimoto, N., et al., The osteoblastic differentiation ability of human dedifferentiated fat cells is higher than that of adipose stem cells from the buccal fat pad. Clin Oral Investig, 2014. 18(8): p. 1893-901.
4. Jumabay, M., et al., Endothelial differentiation in multipotent cells derived from mouse and human white mature adipocytes. J Mol Cell Cardiol, 2012. 53(6): p. 790-800.
5. Long, A., et al., Takayasu's disease: diagnostic and therapeutic value of subclavian artery biopsy. Ann Vasc Surg, 1990. 4(2): p. 151-5.
6. Ohta, Y., et al., Mature adipocyte-derived cells, dedifferentiated fat cells (DFAT), promoted functional recovery from spinal cord injury-induced motor dysfunction in rats. Cell Transplant, 2008. 17(8): p. 877-86.
7. Erickson, G.R., et al., Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 290(2): p. 763-9.
8. Bacou, F., et al., Transplantation of adipose tissue-derived stromal cells increases mass and functional capacity of damaged skeletal muscle. Cell Transplant, 2004. 13(2): p. 103-11.
9. Di Rocco, G., et al., Myogenic potential of adipose-tissue-derived cells. J Cell Sci, 2006. 119(Pt 14): p. 2945-52.
10. Tholpady, S.S., et al., The cellular plasticity of human adipocytes. Ann Plast Surg, 2005. 54(6): p. 651-6.
11. Cawthorn, W.P., E.L. Scheller, and O.A. MacDougald, Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future. J Lipid Res, 2012. 53(2): p. 227-46.
12. Fernyhough, M.E., J.L. Vierck, and M.V. Dodson, Assessing a non-traditional view of adipogenesis: adipocyte dedifferentiation--mountains or molehills? Cells Tissues Organs, 2006. 182(3-4): p. 226-8.
13. Jumabay, M., et al., Pluripotent stem cells derived from mouse and human white mature adipocytes. Stem Cells Transl Med, 2014. 3(2): p. 161-71.
14. Cote, J.A., et al., Role of the TGF-beta pathway in dedifferentiation of human mature adipocytes. FEBS Open Bio, 2017. 7(8): p. 1092-1101.
15. Matsumoto, T., et al., Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J Cell Physiol, 2008. 215(1): p. 210-22.
16. Katz, A.J., et al., Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells, 2005. 23(3): p. 412-23.
17. Schaffler, A. and C. Buchler, Concise review: adipose tissue-derived stromal cells--basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells, 2007. 25(4): p. 818-27.
18. McGann, C.J., S.J. Odelberg, and M.T. Keating, Mammalian myotube dedifferentiation induced by newt regeneration extract. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001. 98(24): p. 13699-704.
19. Harrisingh, M.C., et al., The Ras/Raf/ERK signalling pathway drives Schwann cell dedifferentiation. EMBO J, 2004. 23(15): p. 3061-71.
20. Aitken, K.J., et al., Mammalian target of rapamycin (mTOR) induces proliferation and de-differentiation responses to three coordinate pathophysiologic stimuli (mechanical strain, hypoxia, and extracellular matrix remodeling) in rat bladder smooth muscle. Am J Pathol, 2010. 176(1): p. 304-19.
21. Lafont, J.E., Lack of oxygen in articular cartilage: consequences for chondrocyte biology. Int J Exp Pathol, 2010. 91(2): p. 99-106.
22. Bi, P., et al., Notch activation drives adipocyte dedifferentiation and tumorigenic transformation in mice. J Exp Med, 2016. 213(10): p. 2019-37.
23. Chirumbolo, S. and G. Bjorklund, Can Wnt5a and Wnt non-canonical pathways really mediate adipocyte de-differentiation in a tumour microenvironment? Eur J Cancer, 2016. 64: p. 96-100.
24. Giordano, A., et al., MECHANISMS IN ENDOCRINOLOGY White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. European Journal of Endocrinology, 2014. 170(5): p. R159-R171.
25. Morroni, M., et al., Reversible transdifferentiation of secretory epithelial cells into adipocytes in the mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004. 101(48): p. 16801-16806.
26. Giordano, A., et al., Mammary alveolar epithelial cells convert to brown adipocytes in post-lactating mice. J Cell Physiol, 2017. 232(11): p. 2923-2928.
27. Wang, Q.A., et al., Reversible De-differentiation of Mature White Adipocytes into Preadipocyte-like Precursors during Lactation. Cell Metab, 2018. 28(2): p. 282-288 e3.
28. Marangoni, R.G., et al., Myofibroblasts in murine cutaneous fibrosis originate from adiponectin-positive intradermal progenitors. Arthritis Rheumatol, 2015. 67(4): p. 1062-73.