카테킨 유도체의 항 바이러스성 발현 메카니즘과 응용
2019-11-04
org.kosen.entty.User@259d7a89
권오경(ok55)
1. 개요
최근 지구 온난화와 인적 교류의 가속화에 따라 신흥 바이러스 감염증의 발생이 잇따르고 있다. 특히, 2005년 이후 사우디아라비아 등 중동국가 및 한국에서 1,700명 이상이 감염되며 450명 이상의 사망자를 낸 중동호흡기 증후군의 원인인 MERS-코로나바이러스[1]은 바이러스 감염증은 발생국의 사람들에게 큰 위협을 주며, 사회와 경제에 큰 타격을 주었다.
앞으로도 신흥 바이러스 감염의 발생 가능성은 완전히 부인할 수 없으며, 각 국은 항만 시설에 있어서 감염수입 증례의 물가대책이나 국내에서의 전파확대를 조기에 제압하는 대책을 강구하고 있다. 그러나 바이러스가 인체에 잠복하고 있을 경우, 또는 바이러스 감염자가 이동할 경우를 완전히 제한하는 것은 불가능에 가깝다. 그러므로, 향후 신흥 감염증에 대한 대책은 감염을 미연에 방지하는 예방법의 확립과 감염 후의 중증화를 조기에 억제하는 치료약의 개발이 중요하다. 특히 치사율이 높은 감염증에 대해서는 예방의 중요성이 높으며, 마스크 및 손 소독제로 전개할 수 있는 안전하고, 또 광범위한 바이러스에 대해 불활성화 능력을 가진 새로운 위생제품의 개발이 요구되고 있다.
본 보고서에서는 녹차에 들어 있는 카테킨의 인플루엔자바이러스 감염억제 활성에 착안하여, 그 바이러스 불활성화 능력을 높인 신규 카테킨유도체의 개발에 관심을 갖고, 카테킨유도체의 제조와 그 바이러스감염 억제 메커니즘, 또한 바이러스감염 대책의 실용화에 이르기까지의 연구사례를 정리하고자 하였다.
2. 녹차카테킨
카테킨이 녹차 속에 많이 포함되어 있다는 것은 널리 인식되어 있는데, 그 중 주요한 성분으로는 에피카테킨 (epicatechin, EC, 그림1a)과 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC, 그림1b), 그리고 에피카테킨갈레이트(epicatechin-3-0-gallate, ECG, 그림1c)와 에피갈로카테킨갈레이트 (epigallocatechin-3-0-gallate, EGCG, 그림1d)를 들 수 있으며, 이 성분들의 녹차 중 함유량은 EGCG > EGC > ECG > EC의 순서이다. 이들 화합물의 함유량을 합하면 찻잎의 수분을 제외한 총 중량 중 13~30% 정도를 차지한다.
그림 1. 녹차에 들어 있는 주요 카테킨 화합물. a) Epicatechin (EC), b) Epigallocatechin (EGC),
c) Epicatechin-3-0-gallate (ECG), d) Epigallocatechin-3-0-gallate (EGCG)의 구조식
3. 녹차카테킨의 인플루엔자 바이러스 감염 저해 기구
1949년, 녹차추출물에 항 인플루엔자바이러스 활성이 있다는 것이 Green[2]에 의해 확인되었다. 구체적으로 녹차카테킨의 특정화합물에 초점을 좁혀 항 바이러스 활성을 평가한 것은 1993년의 Nakayama 등에 의한 발표이며, 그들은 녹차추출물에 포함된 카테킨의 주요성분인 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)를 인플루엔자A/H1N1, B형바이러스와 직접 작용시키면, 바이러스의 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney : MDCK) 배양세포에 대한 감염이 저해되는 것을 보고했다[3].
인플루엔자바이러스는 표면에 존재하는 헤마글루티닌 단백질을 사용해 세포 표면의 시알산에 결합함으로써 세포와의 접착을 성립시킨다(그림2). Nakayama들은 EGCG가 인플루엔자바이러스의 MDCK세포에 대한 접착과정을 저해시키는 것을 확인했다. 이 결과는 EGCG가 바이러스 입자 표면의 헤마글루티닌 단백질에 작용하며, 세포 표면의 시알산과의 결합을 저해한다는 결과를 시사했다.
2005년 Song들은 녹차카테킨류 중, 3위에 갈로일기를 가진 EGCG(그림1d)와 ECG(그림1c)가 인플루엔자A/H1N1, A/H3N2, B형바이러스의 MDCK세포에 대한 감염을 저해하는 것을 확인했다[4]. 또한 EGCG, ECG는 바이러스의 세포접착, 유전자 복제, 출아의 각 단계를 저해하는 것을 확인했다(그림2). 한편, EGC(그림1b)에는 현저한 감염 저해효과가 확인되지 않았던 점에서, 카테킨골격의 3위에 갈로일기가 있는 것이 인플루엔자바이러스의 감염저해에 중요하다는 것, 2위의 트리히드록시 환상에 있는 5'위 수산기의 유무는 활성에 그다지 영향을 주지 않는 것을 밝혔다.
그림 2. 인플루엔자바이러스의 세포에 대한 감염기구와 카테킨 및
기존 약의 감염저해 단계에 관한 개략도
따라서, EGCG는 인플루엔자바이러스의 입자의 막표면에 존재하는 단백질인 헤마글루티닌 (hemagglutinin)이나 뉴라미니다아제(neuraminidase)에 작용해, 세포에의 접착, 막융합, 출아 등 여러 과정을 저해하는 것으로 밝혀졌다.
실제로 EGCG를 부직포 등에 함침 후, 건조시킨 EGCG 함침포를 제조하여 여름철의 고온·습윤에 노출하면 황색~갈색으로 변색하며, 항바이러스 효과가 저하되는 것으로 알려져 있다. 이러한 원인으로서는 EGCG가 흡습에 의해 pH중성~염기성 조건에 노출되면, B환상의 페놀성 수산기가 산화된 세미퀴논 라디칼 구조로 되며, 이어 디케톤으로 변환 됨으로써 분자 간에서 중합을 일으켰기 때문이라고 생각된다(그림3)[5].
그림 3. 생리적 환경 하에서 EGCG의 구조변화
( R : -OH, R' : -Galloyl, B환의 페놀성 수산기는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 존재 하에 산화되어 세미퀴논 라디칼 구조를 형성하고,또 디케톤체로 변환된 후, 중합반응을 일으킨다)
4. 항바이러스 활성을 갖는 카테킨 유도체의 제조
EGCG의 화학적 안정성 및 항바이러스 활성을 높이기 위해서는 B환상에 존재하는 페놀성 수산기에 대한 보호기를 도입해 산화분해나 중합반응을 억제함과 동시에, 보호기로서 바이러스 막에 친화력을 높일 수 있는 치환기를 도입하는 것이 유효하다고 생각된다. 그러나 유기화학적인 방법을 이용한 경우, EGCG 골격에 포함된 8개 페놀성 수산기의 다른 위치에 보호기가 도입되거나, 여러 위치에 보호기가 도입됐는데도 혼합물이 얻어지기도 하기 때문에, 생성물을 차단하는 것이 어렵다고 여겨진다.
그래서 연구자들은 산소반응을 이용해 EGCG의 페놀성 수산기에 1분자만 보호기를 도입하는 것을 검토했다. 리파제는 산소 중에서도 기질이 되는 화합물의 페놀성 수산기 구조를 정확히 식별해 촉매활성부위에 가져와, 지방산을 위치특이적으로 에스테르결합에 의해 도입할 수 있다. 그래서 연구자들은 리파제 촉매 에스테르화 반응을 이용해 EGCG의 페놀성 수산기에 아실기를 위치 특이적으로 도입하고, 그 화학안정성을 높이면서 항인플루엔자바이러스 활성을 향상할 수 있는지를 검토했다.
예의 검토의 결과, EGCG를 친수성 유기용매에 용해하고, 리파제와 아실도너인 지방산 비닐에스테르를 반응시키면, B환의 R1, R2, 혹은 D환의 R3, R4의 위치에 하나만 지방산(-R)을 에스테르결합에 의해 도입한 모노에스테르 유도체를 합성할 수 있는 것을 발견했다(그림4)[6].
그림 4. 리파제 촉매 아실화 반응을 이용한 EGCG 지방산 모노에스테르의 합성
(친수유기용매에 EGCG를 용해하고, 리파제와 아실도너인 지방산 비닐에스테르를 반응시키면,
B환의 R1, R2, 혹은 D환의 R3, R4의 위치 중 하나가 한곳에 지방산(-R)이 에스테르결합에 의해 도입된다)
위 방법을 이용해 EGCG에 길이가 다른 지방산을 1분자 도입한 EGCG 모노에스테르 유도체 라이브러리를 조정했다(표1). 각 EGCG유도체의 세포배양액 중에 있어서의 화학안정성을 평가 한 결과, EGCG에 탄소쇄장이 12~18인 지방산을 도입하면 화학안정성이 향상되며, EGCG 모노 팔미토일에스테르의 경우는 EGCG에 비해 그 화학구조 안정성이 약 10배 향상하는 것으로 밝혀졌다(그림5).
표 1. 리파제 촉매 아실화 반응에 의해 조정된 EGCG 모노 에스테르 유도체 라이브러리.
[각 화합물의 아실기에 포함된 탄소수는 각각 8(C8), 12(C12), 16(C16), 20(C20)이며, 각 EGCG 모노에스테르 유도체의 위치 이성체 비율은 기재와 같다]
그림 5. EGCG, 또는 EGCG-C16의 인산 완충액(pH7.4) 중에 있어서의 화학구조 안정성
4.1. 카테킨 유도체의 항바이러스 활성
연구자들은 상기의 EGCG 모노에스테르 유도체 라이브러리를 이용해, 인플루엔자바이러스A/PR/8/34/H1N1가 MDCK세포에 감염하는 과정을 저해할 수 있는지 평가했다. 그 결과, EGCG 모노에스테르 유도체를 바이러스에 직접 작용시키면 인플루엔자바이러스 세포에의 감염을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인했다(그림6).
그림 6. EGCG, 또는 EGCG 모노에스테르 유도체를 인플루엔자바이러스와
직접 30분간 작용시킨 경우의 감염저해효과
또한 흥미롭게도, EGCG 모노에스테르 유도체의 인플루엔자바이러스(A/Puerto Rico/34 (H1N1))에 대한 감염 불활화 활성은 도입된 지방산의 길이에 의존해 향상하며, 그 탄소괘가 C12-18의 경우에 양호한 것을 발견했다(표2).
표 2. EGCG, 또는 EGCG 모노에스테르 유도체를 인플루엔자바이러스[A/Puerto Rico/34(H1N1))에 직접 30분간 작용시킨 경우의 감염 50% 저해농도(EC50)와 개 신장 배양(MDCK)세포에 대한 독성 50% 발현농도(CC50), 및 Selectivity Index(CC50/EC50)의 비교]
또한 EGCG에 대해 팔미토일기를 1분자 도입한 EGCG 팔미틴산 모노에스테르(EGCG-C16), 계절성의 A/H1N1, A/H3N2나 B형바이러스뿐만 아니라, 2008-09년에 대유행을 일으킨 신형A/H1N1바이러스, 또한 그 중에서도 타미플루 내성주나 아만타딘 내성주, 그리고 조류 감염성A/H5N2 바이러스 등 MDCK세포에 대한 감염을 효과적으로 저해하는 것을 나타났다[7].
표 3. EGCG, 또는 EGCG-C16의 각종 인플루엔자바이러스에 대한 감염저해활성
4.2. 카테킨 유도체의 항바이러스 메커니즘
EGCG 모노에스테르 유도체의 작용기구를 평가하기 위해 투과형 전자현미경을 이용해 바이러스입자에 EGCG-C16을 작용시켰을 경우의 형태변화를 관찰했다. 그 결과, EGCG-C16 농도의존적으로 바이러스의 막구조가 변성하며, 최종적으로 바이러스입자가 붕괴하는 결과를 얻었다(그림7).
EGCG 모노에스테르 유도체를 인플루엔자바이러스에 작용시켜, 세포감염에 있어서 어떤 단계를 저해하는지 조사했다. 그림8은 a)바이러스를 개 신장배양(MDCK)세포에 감염시킨 경우, b)바이러스와 EGCG 모노팔미토일을 미리 작용시키고 나서 세포에 감염시켰을 경우의 세포 내에서의 바이러스단백질의 발현을 형광면역염색법으로 비교했다. 그 결과, EGCG 모노팔미토일을 미리 작용시키면 바이러스단백질이 발현까지의 감염 초기단계를 저해한 것으로 밝혀졌다.
그림 7. 투과형 전자현미경을 사용한 인플루엔자바이러스((A/Puerto Rico/34(H1N1)))의 입자형태 관찰 [ a)는 인플루엔자바이러스만, b-d)는 인플루엔자바이러스에 EGCG-C16을 각각 2nM, 20nM,또는 500nM 첨가한 경우의 바이러스입자 구조의 관찰결과 ]
그림 8. 개 신장배양(MDCK)세포 내에서의 인플루엔자바이러스 단백질의 발현을 형광면역염색으로 해석[ (왼쪽)바이러스를 처리없이 MDCK세포에 감염시켰다. 오른쪽)바이러스를 EGCG-C16와 30분간 인큐베이트하고 나서 MDCK세포에 감염시켰다]
5. 카테킨 유도체의 항바이러스 응용
전술한 바와 같이 EGCG에 지방산을 도입하면 그 화학안정성, 항인플루엔자바이러스 활성이 비약적으로 향상하는 것을 알 수 있다. 따라서 EGCG 모노에스테르 유도체를 다양한 산화방지제나 계면활성제와 함께 부직포에 함침시키고, 그 착색 및 항인플루엔자바이러스 활성에 미치는 영향을 조사했다.
구체적으로는, 온도 55℃에서의 가속시험을 한달 동안 실시한 결과, 통상의 EGCG 함침 부직포의 경우에는 현저한 착색이 보였으나, EGCG 모노에스테르 유도체의 경우는 눈에 띄는 착색은 확인되지 않았다. 그래서 항인플루엔자바이러스 활성을 평가한 결과, 적어도 3년에 해당하는 가속 시험을 실시하더라도 활성이 유지되고 있는 것을 확인했다.
이어 EGCG 모노에스테르 유도체를 함침시킨 부직포의 항바이러스 활성을 기존의 항바이러스 소재인 항체함침섬유, 은섬유, 산화티탄섬유, 4급암모늄계섬유, 키토산함유섬유와 비교했다. 그 결과, 은섬유를 제외하고는 항체, 산화티탄, 4급암모늄염, 키토산 등을 함침시킨 기존 섬유는 이 바이러스의 감염을 한자리 수 수준으로(90%) 저해했다(그림9). EGCG 모노에스테르 함침 섬유에 대해서는 같은 바이러스의 감염을 3자리 수 수준으로(99.9 %) 저해하는 것을 확인했다(그림9).
그림 9. EGCG 모노에스테르 함침섬유의 인플루엔자바이러스 불활화활성을
기존의 항바이러스성 섬유와 비교
그림 9에서 볼 수 있듯이, EGCG 모노에스테르 함침섬유는 기존의 항바이러스 감염대책부재에 비해 압도적으로 높은 항바이러스 활성을 나타내는 점에서, 막성분을 가진 다른 바이러스감염 대책에 효과적인 것을 알 수 있다.
지금까지 EGCG 모노에스테르 유도체의 막바이러스에 대한 감염저해활성에 대해 언급했는데, 노로바이러스와 같은 지질막이 없고, 단백질 껍질로 덮여 있는 바이러스에의 불활화활성에 대해서도 평가했다.
노로바이러스의 감염실험을 배양세포로 실시하는 계는 확립되어 있지 않으므로, 대체바이러스로서 고양이칼리시바이러스를 이용하며, EGCG와 EGCG 모노에스테르 유도체의 용액을 0.02% 단백질 부하조건에 있어서 작용시킨 경우의 고양이 신장세포에의 감염저해효과를 평가했다. 그 결과, EGCG의 경우는 50μM 농도로도 바이러스 감염역가의 대수감소치는 한자리 수에 못했으나, EGCG 모노에스테르 유도체는 같은 농도로 바이러스 감염역가의 대수감소치는 3자리 수 이상 (99.9% 이상 불활화)이 되는 것으로 밝혀졌다(그림10).
그림 10. EGCG, EGCG 모노에스테르 유도체의 수용액을 고양이칼리시바이러스에
직접 작용시킨 경우의 고양이 신장배양(CRFK)세포에 대한 감염저해활성
EGCG 및 EGCG 모노에스테르 유도체의 항고양이칼리시바이러스 활성을 기존의 항바이러스제와 비교하면, 클로르헥시딘이나 염화벤잘코늄 및 EGCG는 대부분 바이러스 불활화효과를 나타내지 않았으나, 차아염소산나트륨과 EGCG 모노에스테르 유도체에 대해서는 감염역가를 3자리 수 이상 감소시키는 것이 밝혀졌다(그림11).
그림 11. EGCG, EGCG 모노에스테르 유도체, 및 기존 제바이러스제의 감염저해활성의 비교
차아염소산나트륨과 EGCG 모노에스테르 유도체에 대해, 고양이칼리시바이러스를 50% 저해하는 농도와 세포독성을 50% 야기하는 농도를 비교 한 결과, 차아염소산나트륨은 항고양이칼리시 바이러스 활성을 나타내는 7배로 세포독성을 야기하는 반면, EGCG 모노에스테르 유도체는 항고양이칼리시바이러스를 나타내는 농도의 2,800배 더한 경우에 세포독성을 나타내는 결과를 얻었다. 이상의 결과로부터 EGCG 모노에스테르 유도체는 생체안정성이 우수하며, 항바이러스 활성이 높은 것으로 밝혀졌다(표4).
표 4. 차아염소산나트륨, 또는 EGCG 모노에스테르 유도체의 고양이칼리시바이러스 50% 불활화농도(EC50)와 고양이 신장배양(MDCK)세포의 50% 독성야기농도(CC50) 및 Selectivity Index(CC50/EC50)의 비교
6. 결론
리파제 촉매 에스테르화 반응을 이용해 EGCG의 페놀성 수산기에 길이가 다른 지방산을 하나 도입한 EGCG 모노에스테르 유도체를 합성했다. EGCG 모노에스테르 유도체는 화학 안정성이 우수하며, 인플루엔자바이러스와 같은 막바이러스, 고양이 칼리시바이러스와 같은 비막바이러스의 세포에 대한 감염을 효과적으로 저해하는 것을 확인했다. EGCG 모노에스테르 유도체를 부직포에 함침시킨 경우도 인플루엔자바이러스 저해활성은 유지되고 있으며, 기존의 항바이러스 섬유에 대한 우위성이 확인됐다. EGCG 모노에스테르 유도체는 기존의 제바이러스제에 비해 안전하고 강력한 항바이러스제로서의 응용이 기대된다.
References
최근 지구 온난화와 인적 교류의 가속화에 따라 신흥 바이러스 감염증의 발생이 잇따르고 있다. 특히, 2005년 이후 사우디아라비아 등 중동국가 및 한국에서 1,700명 이상이 감염되며 450명 이상의 사망자를 낸 중동호흡기 증후군의 원인인 MERS-코로나바이러스[1]은 바이러스 감염증은 발생국의 사람들에게 큰 위협을 주며, 사회와 경제에 큰 타격을 주었다.
앞으로도 신흥 바이러스 감염의 발생 가능성은 완전히 부인할 수 없으며, 각 국은 항만 시설에 있어서 감염수입 증례의 물가대책이나 국내에서의 전파확대를 조기에 제압하는 대책을 강구하고 있다. 그러나 바이러스가 인체에 잠복하고 있을 경우, 또는 바이러스 감염자가 이동할 경우를 완전히 제한하는 것은 불가능에 가깝다. 그러므로, 향후 신흥 감염증에 대한 대책은 감염을 미연에 방지하는 예방법의 확립과 감염 후의 중증화를 조기에 억제하는 치료약의 개발이 중요하다. 특히 치사율이 높은 감염증에 대해서는 예방의 중요성이 높으며, 마스크 및 손 소독제로 전개할 수 있는 안전하고, 또 광범위한 바이러스에 대해 불활성화 능력을 가진 새로운 위생제품의 개발이 요구되고 있다.
본 보고서에서는 녹차에 들어 있는 카테킨의 인플루엔자바이러스 감염억제 활성에 착안하여, 그 바이러스 불활성화 능력을 높인 신규 카테킨유도체의 개발에 관심을 갖고, 카테킨유도체의 제조와 그 바이러스감염 억제 메커니즘, 또한 바이러스감염 대책의 실용화에 이르기까지의 연구사례를 정리하고자 하였다.
2. 녹차카테킨
카테킨이 녹차 속에 많이 포함되어 있다는 것은 널리 인식되어 있는데, 그 중 주요한 성분으로는 에피카테킨 (epicatechin, EC, 그림1a)과 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC, 그림1b), 그리고 에피카테킨갈레이트(epicatechin-3-0-gallate, ECG, 그림1c)와 에피갈로카테킨갈레이트 (epigallocatechin-3-0-gallate, EGCG, 그림1d)를 들 수 있으며, 이 성분들의 녹차 중 함유량은 EGCG > EGC > ECG > EC의 순서이다. 이들 화합물의 함유량을 합하면 찻잎의 수분을 제외한 총 중량 중 13~30% 정도를 차지한다.
그림 1. 녹차에 들어 있는 주요 카테킨 화합물. a) Epicatechin (EC), b) Epigallocatechin (EGC),
c) Epicatechin-3-0-gallate (ECG), d) Epigallocatechin-3-0-gallate (EGCG)의 구조식
3. 녹차카테킨의 인플루엔자 바이러스 감염 저해 기구
1949년, 녹차추출물에 항 인플루엔자바이러스 활성이 있다는 것이 Green[2]에 의해 확인되었다. 구체적으로 녹차카테킨의 특정화합물에 초점을 좁혀 항 바이러스 활성을 평가한 것은 1993년의 Nakayama 등에 의한 발표이며, 그들은 녹차추출물에 포함된 카테킨의 주요성분인 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)를 인플루엔자A/H1N1, B형바이러스와 직접 작용시키면, 바이러스의 개 신장(Madin-Darby Canine Kidney : MDCK) 배양세포에 대한 감염이 저해되는 것을 보고했다[3].
인플루엔자바이러스는 표면에 존재하는 헤마글루티닌 단백질을 사용해 세포 표면의 시알산에 결합함으로써 세포와의 접착을 성립시킨다(그림2). Nakayama들은 EGCG가 인플루엔자바이러스의 MDCK세포에 대한 접착과정을 저해시키는 것을 확인했다. 이 결과는 EGCG가 바이러스 입자 표면의 헤마글루티닌 단백질에 작용하며, 세포 표면의 시알산과의 결합을 저해한다는 결과를 시사했다.
2005년 Song들은 녹차카테킨류 중, 3위에 갈로일기를 가진 EGCG(그림1d)와 ECG(그림1c)가 인플루엔자A/H1N1, A/H3N2, B형바이러스의 MDCK세포에 대한 감염을 저해하는 것을 확인했다[4]. 또한 EGCG, ECG는 바이러스의 세포접착, 유전자 복제, 출아의 각 단계를 저해하는 것을 확인했다(그림2). 한편, EGC(그림1b)에는 현저한 감염 저해효과가 확인되지 않았던 점에서, 카테킨골격의 3위에 갈로일기가 있는 것이 인플루엔자바이러스의 감염저해에 중요하다는 것, 2위의 트리히드록시 환상에 있는 5'위 수산기의 유무는 활성에 그다지 영향을 주지 않는 것을 밝혔다.
그림 2. 인플루엔자바이러스의 세포에 대한 감염기구와 카테킨 및
기존 약의 감염저해 단계에 관한 개략도
따라서, EGCG는 인플루엔자바이러스의 입자의 막표면에 존재하는 단백질인 헤마글루티닌 (hemagglutinin)이나 뉴라미니다아제(neuraminidase)에 작용해, 세포에의 접착, 막융합, 출아 등 여러 과정을 저해하는 것으로 밝혀졌다.
실제로 EGCG를 부직포 등에 함침 후, 건조시킨 EGCG 함침포를 제조하여 여름철의 고온·습윤에 노출하면 황색~갈색으로 변색하며, 항바이러스 효과가 저하되는 것으로 알려져 있다. 이러한 원인으로서는 EGCG가 흡습에 의해 pH중성~염기성 조건에 노출되면, B환상의 페놀성 수산기가 산화된 세미퀴논 라디칼 구조로 되며, 이어 디케톤으로 변환 됨으로써 분자 간에서 중합을 일으켰기 때문이라고 생각된다(그림3)[5].
그림 3. 생리적 환경 하에서 EGCG의 구조변화
( R : -OH, R' : -Galloyl, B환의 페놀성 수산기는 슈퍼옥사이드 음이온 라디칼 존재 하에 산화되어 세미퀴논 라디칼 구조를 형성하고,또 디케톤체로 변환된 후, 중합반응을 일으킨다)
4. 항바이러스 활성을 갖는 카테킨 유도체의 제조
EGCG의 화학적 안정성 및 항바이러스 활성을 높이기 위해서는 B환상에 존재하는 페놀성 수산기에 대한 보호기를 도입해 산화분해나 중합반응을 억제함과 동시에, 보호기로서 바이러스 막에 친화력을 높일 수 있는 치환기를 도입하는 것이 유효하다고 생각된다. 그러나 유기화학적인 방법을 이용한 경우, EGCG 골격에 포함된 8개 페놀성 수산기의 다른 위치에 보호기가 도입되거나, 여러 위치에 보호기가 도입됐는데도 혼합물이 얻어지기도 하기 때문에, 생성물을 차단하는 것이 어렵다고 여겨진다.
그래서 연구자들은 산소반응을 이용해 EGCG의 페놀성 수산기에 1분자만 보호기를 도입하는 것을 검토했다. 리파제는 산소 중에서도 기질이 되는 화합물의 페놀성 수산기 구조를 정확히 식별해 촉매활성부위에 가져와, 지방산을 위치특이적으로 에스테르결합에 의해 도입할 수 있다. 그래서 연구자들은 리파제 촉매 에스테르화 반응을 이용해 EGCG의 페놀성 수산기에 아실기를 위치 특이적으로 도입하고, 그 화학안정성을 높이면서 항인플루엔자바이러스 활성을 향상할 수 있는지를 검토했다.
예의 검토의 결과, EGCG를 친수성 유기용매에 용해하고, 리파제와 아실도너인 지방산 비닐에스테르를 반응시키면, B환의 R1, R2, 혹은 D환의 R3, R4의 위치에 하나만 지방산(-R)을 에스테르결합에 의해 도입한 모노에스테르 유도체를 합성할 수 있는 것을 발견했다(그림4)[6].
그림 4. 리파제 촉매 아실화 반응을 이용한 EGCG 지방산 모노에스테르의 합성
(친수유기용매에 EGCG를 용해하고, 리파제와 아실도너인 지방산 비닐에스테르를 반응시키면,
B환의 R1, R2, 혹은 D환의 R3, R4의 위치 중 하나가 한곳에 지방산(-R)이 에스테르결합에 의해 도입된다)
위 방법을 이용해 EGCG에 길이가 다른 지방산을 1분자 도입한 EGCG 모노에스테르 유도체 라이브러리를 조정했다(표1). 각 EGCG유도체의 세포배양액 중에 있어서의 화학안정성을 평가 한 결과, EGCG에 탄소쇄장이 12~18인 지방산을 도입하면 화학안정성이 향상되며, EGCG 모노 팔미토일에스테르의 경우는 EGCG에 비해 그 화학구조 안정성이 약 10배 향상하는 것으로 밝혀졌다(그림5).
표 1. 리파제 촉매 아실화 반응에 의해 조정된 EGCG 모노 에스테르 유도체 라이브러리.
[각 화합물의 아실기에 포함된 탄소수는 각각 8(C8), 12(C12), 16(C16), 20(C20)이며, 각 EGCG 모노에스테르 유도체의 위치 이성체 비율은 기재와 같다]
| EGCG 모노에스테르 유도체 | 위치 이성질체 비율(R1 : R2 : R3 : R4) |
| EGCG 모노옥탄오일 (C8) | 35:39:6:20 |
| EGCG 모노라우로일 (C12) | 30:39:9:22 |
| EGCG 모노팔미토일 (C16) | 38:35:7:20 |
| EGCG 모노에이코산오일 (C20) | 38:36:8:19 |
그림 5. EGCG, 또는 EGCG-C16의 인산 완충액(pH7.4) 중에 있어서의 화학구조 안정성
4.1. 카테킨 유도체의 항바이러스 활성
연구자들은 상기의 EGCG 모노에스테르 유도체 라이브러리를 이용해, 인플루엔자바이러스A/PR/8/34/H1N1가 MDCK세포에 감염하는 과정을 저해할 수 있는지 평가했다. 그 결과, EGCG 모노에스테르 유도체를 바이러스에 직접 작용시키면 인플루엔자바이러스 세포에의 감염을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인했다(그림6).
그림 6. EGCG, 또는 EGCG 모노에스테르 유도체를 인플루엔자바이러스와
직접 30분간 작용시킨 경우의 감염저해효과
또한 흥미롭게도, EGCG 모노에스테르 유도체의 인플루엔자바이러스(A/Puerto Rico/34 (H1N1))에 대한 감염 불활화 활성은 도입된 지방산의 길이에 의존해 향상하며, 그 탄소괘가 C12-18의 경우에 양호한 것을 발견했다(표2).
표 2. EGCG, 또는 EGCG 모노에스테르 유도체를 인플루엔자바이러스[A/Puerto Rico/34(H1N1))에 직접 30분간 작용시킨 경우의 감염 50% 저해농도(EC50)와 개 신장 배양(MDCK)세포에 대한 독성 50% 발현농도(CC50), 및 Selectivity Index(CC50/EC50)의 비교]
또한 EGCG에 대해 팔미토일기를 1분자 도입한 EGCG 팔미틴산 모노에스테르(EGCG-C16), 계절성의 A/H1N1, A/H3N2나 B형바이러스뿐만 아니라, 2008-09년에 대유행을 일으킨 신형A/H1N1바이러스, 또한 그 중에서도 타미플루 내성주나 아만타딘 내성주, 그리고 조류 감염성A/H5N2 바이러스 등 MDCK세포에 대한 감염을 효과적으로 저해하는 것을 나타났다[7].
표 3. EGCG, 또는 EGCG-C16의 각종 인플루엔자바이러스에 대한 감염저해활성
4.2. 카테킨 유도체의 항바이러스 메커니즘
EGCG 모노에스테르 유도체의 작용기구를 평가하기 위해 투과형 전자현미경을 이용해 바이러스입자에 EGCG-C16을 작용시켰을 경우의 형태변화를 관찰했다. 그 결과, EGCG-C16 농도의존적으로 바이러스의 막구조가 변성하며, 최종적으로 바이러스입자가 붕괴하는 결과를 얻었다(그림7).
EGCG 모노에스테르 유도체를 인플루엔자바이러스에 작용시켜, 세포감염에 있어서 어떤 단계를 저해하는지 조사했다. 그림8은 a)바이러스를 개 신장배양(MDCK)세포에 감염시킨 경우, b)바이러스와 EGCG 모노팔미토일을 미리 작용시키고 나서 세포에 감염시켰을 경우의 세포 내에서의 바이러스단백질의 발현을 형광면역염색법으로 비교했다. 그 결과, EGCG 모노팔미토일을 미리 작용시키면 바이러스단백질이 발현까지의 감염 초기단계를 저해한 것으로 밝혀졌다.
그림 7. 투과형 전자현미경을 사용한 인플루엔자바이러스((A/Puerto Rico/34(H1N1)))의 입자형태 관찰 [ a)는 인플루엔자바이러스만, b-d)는 인플루엔자바이러스에 EGCG-C16을 각각 2nM, 20nM,또는 500nM 첨가한 경우의 바이러스입자 구조의 관찰결과 ]
그림 8. 개 신장배양(MDCK)세포 내에서의 인플루엔자바이러스 단백질의 발현을 형광면역염색으로 해석[ (왼쪽)바이러스를 처리없이 MDCK세포에 감염시켰다. 오른쪽)바이러스를 EGCG-C16와 30분간 인큐베이트하고 나서 MDCK세포에 감염시켰다]
5. 카테킨 유도체의 항바이러스 응용
전술한 바와 같이 EGCG에 지방산을 도입하면 그 화학안정성, 항인플루엔자바이러스 활성이 비약적으로 향상하는 것을 알 수 있다. 따라서 EGCG 모노에스테르 유도체를 다양한 산화방지제나 계면활성제와 함께 부직포에 함침시키고, 그 착색 및 항인플루엔자바이러스 활성에 미치는 영향을 조사했다.
구체적으로는, 온도 55℃에서의 가속시험을 한달 동안 실시한 결과, 통상의 EGCG 함침 부직포의 경우에는 현저한 착색이 보였으나, EGCG 모노에스테르 유도체의 경우는 눈에 띄는 착색은 확인되지 않았다. 그래서 항인플루엔자바이러스 활성을 평가한 결과, 적어도 3년에 해당하는 가속 시험을 실시하더라도 활성이 유지되고 있는 것을 확인했다.
이어 EGCG 모노에스테르 유도체를 함침시킨 부직포의 항바이러스 활성을 기존의 항바이러스 소재인 항체함침섬유, 은섬유, 산화티탄섬유, 4급암모늄계섬유, 키토산함유섬유와 비교했다. 그 결과, 은섬유를 제외하고는 항체, 산화티탄, 4급암모늄염, 키토산 등을 함침시킨 기존 섬유는 이 바이러스의 감염을 한자리 수 수준으로(90%) 저해했다(그림9). EGCG 모노에스테르 함침 섬유에 대해서는 같은 바이러스의 감염을 3자리 수 수준으로(99.9 %) 저해하는 것을 확인했다(그림9).
그림 9. EGCG 모노에스테르 함침섬유의 인플루엔자바이러스 불활화활성을
기존의 항바이러스성 섬유와 비교
그림 9에서 볼 수 있듯이, EGCG 모노에스테르 함침섬유는 기존의 항바이러스 감염대책부재에 비해 압도적으로 높은 항바이러스 활성을 나타내는 점에서, 막성분을 가진 다른 바이러스감염 대책에 효과적인 것을 알 수 있다.
지금까지 EGCG 모노에스테르 유도체의 막바이러스에 대한 감염저해활성에 대해 언급했는데, 노로바이러스와 같은 지질막이 없고, 단백질 껍질로 덮여 있는 바이러스에의 불활화활성에 대해서도 평가했다.
노로바이러스의 감염실험을 배양세포로 실시하는 계는 확립되어 있지 않으므로, 대체바이러스로서 고양이칼리시바이러스를 이용하며, EGCG와 EGCG 모노에스테르 유도체의 용액을 0.02% 단백질 부하조건에 있어서 작용시킨 경우의 고양이 신장세포에의 감염저해효과를 평가했다. 그 결과, EGCG의 경우는 50μM 농도로도 바이러스 감염역가의 대수감소치는 한자리 수에 못했으나, EGCG 모노에스테르 유도체는 같은 농도로 바이러스 감염역가의 대수감소치는 3자리 수 이상 (99.9% 이상 불활화)이 되는 것으로 밝혀졌다(그림10).
그림 10. EGCG, EGCG 모노에스테르 유도체의 수용액을 고양이칼리시바이러스에
직접 작용시킨 경우의 고양이 신장배양(CRFK)세포에 대한 감염저해활성
EGCG 및 EGCG 모노에스테르 유도체의 항고양이칼리시바이러스 활성을 기존의 항바이러스제와 비교하면, 클로르헥시딘이나 염화벤잘코늄 및 EGCG는 대부분 바이러스 불활화효과를 나타내지 않았으나, 차아염소산나트륨과 EGCG 모노에스테르 유도체에 대해서는 감염역가를 3자리 수 이상 감소시키는 것이 밝혀졌다(그림11).
그림 11. EGCG, EGCG 모노에스테르 유도체, 및 기존 제바이러스제의 감염저해활성의 비교
차아염소산나트륨과 EGCG 모노에스테르 유도체에 대해, 고양이칼리시바이러스를 50% 저해하는 농도와 세포독성을 50% 야기하는 농도를 비교 한 결과, 차아염소산나트륨은 항고양이칼리시 바이러스 활성을 나타내는 7배로 세포독성을 야기하는 반면, EGCG 모노에스테르 유도체는 항고양이칼리시바이러스를 나타내는 농도의 2,800배 더한 경우에 세포독성을 나타내는 결과를 얻었다. 이상의 결과로부터 EGCG 모노에스테르 유도체는 생체안정성이 우수하며, 항바이러스 활성이 높은 것으로 밝혀졌다(표4).
표 4. 차아염소산나트륨, 또는 EGCG 모노에스테르 유도체의 고양이칼리시바이러스 50% 불활화농도(EC50)와 고양이 신장배양(MDCK)세포의 50% 독성야기농도(CC50) 및 Selectivity Index(CC50/EC50)의 비교
6. 결론
리파제 촉매 에스테르화 반응을 이용해 EGCG의 페놀성 수산기에 길이가 다른 지방산을 하나 도입한 EGCG 모노에스테르 유도체를 합성했다. EGCG 모노에스테르 유도체는 화학 안정성이 우수하며, 인플루엔자바이러스와 같은 막바이러스, 고양이 칼리시바이러스와 같은 비막바이러스의 세포에 대한 감염을 효과적으로 저해하는 것을 확인했다. EGCG 모노에스테르 유도체를 부직포에 함침시킨 경우도 인플루엔자바이러스 저해활성은 유지되고 있으며, 기존의 항바이러스 섬유에 대한 우위성이 확인됐다. EGCG 모노에스테르 유도체는 기존의 제바이러스제에 비해 안전하고 강력한 항바이러스제로서의 응용이 기대된다.
References
- WHO, Disease outbreak news, Middle East respiratory syndrome coronavirus(MERS-CoV)-United Arab Emirates, 6 June 2015
- R. H. Green, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 71(1),84 (1949)
- M. Nakayama, K. Suzuki, M. Toda, S. Okubo, Y. Hara, T. Shimamura, Antiviral Res., 21 (4) ,289(1993)
- J. M. Song, K. H. Lee, B. I. Seong, Antiviral Res., 68 (2), 66 (2005)
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