보튤라이늄 신경독소 단백질의 공학 및 개발 동향
2019-11-13
org.kosen.entty.User@4033eae2
이평강(lpg2314)
1. 개요
보튤라이늄 신경독소(Botulinum neurotoxin: Botox, 이하 보톡스)는 토양 미생물인 Clostridium botulinum에 의해 합성되는 단백질 독소로서 포유 동물의 신경 세포에 작용해 신경 세포 간 신경전달물질의 전달을 억제함으로써 이완성 마비(flaccid paralysis)를 유발한다. 보톡스는 매우 소량으로도 포유 동물에게 신경독을 나타낼 수 있으며 자연계에서는 주로 Clostridium botulinum에 오염된 음식을 섭취함으로써 체내에 유입되어 보튤리즘(botulism)을 야기한다. 지금까지 보고된 보톡스의 항원형은 7개(A to G)로 알려져 있으며, 대체로 반수 치사량이 kg당 ~1 ng 수준으로써 매우 높은 독성을 나타내기 때문에 생화학 무기로서 이용될 수 있다[1]. 또한, 소량의 보톡스가 이완성 마비를 유발하고 체내에서 최대 6개월까지 잔류 활성을 보인다는 특성을 이용해 희석액이 의료 및 미용 목적으로 이용되어 왔다. 최근에는 우울증이나 편두통, 당뇨로 유발된 실명 예방에도 보톡스의 임상 시험이 활발히 진행되고 있다. 이와 같은 보톡스의 응용은 점점 응용 분야가 넓어지고 있으며, 그에 따라 필요에 따른 단백질 변형 및 개발이 수행되고 있다. 본 보고서에서는 보톡스의 최근 개발 현황과 단백질 공학의 연구 동향에 대해서 소개한다.
2. 보톡스 단백질 독소 연구
2.1. 보톡스 단백질 독소의 구조 및 작용 기전
보톡스 단백질(BoNT)은 150 kDa의 비교적 큰 분자량을 갖는 single chain 단백질이다. 단백질 각 도메인의 기능에 따라 3개의 도메인으로 나뉘며, 이는 단백질 분해효소(protease) 도메인(light chain, LC), 세포질 전달(translocation) 도메인(N-terminal heavy chain, HN), 수용체 결합(receptor binding) 도메인(C-terminanl heavy chain, HC)으로 구성된다(그림 1). 보톡스가 신경세포(neuron)에 노출되면 수용체 결합 도메인이 뉴런 막단백질인 synaptic vesicle 2 protein 또는 synaptotagmin 특이적으로 결합한다. 이 때 뉴런 표면의 ganglioside의 당 moiety 또한 수용체 결합 도메인과 상호작용하여 결합 친화도에 영향을 준다고 알려져 있다[2]. 뉴런의 막에 선택적으로 붙은 보톡스는 내포 작용(endocytosis)에 의해 liposome으로 유입되며 liposome의 pH가 낮아짐에 따라 translocation 도메인의 특정 부위의 구조가 switch로 작용하여 liposome의 막에 pore를 형성하게 되고[3], 단백질 분해효소 도메인이 partial denaturation과정을 거쳐 뉴런의 세포질로 이동한 후 다시 functional한 분해효소로서 접힌다. 이 과정 중 단백질 분해효소 도메인이 세포질 전달 도메인으로부터 이탈할 수 있는 이유는 이 두 도메인을 잇는 loop가 체내 존재하는 다른 protease들에 의해 절단되고, liposome 내의 환원적 환경이 다시 한 번 두 도메인을 잇는 di-sulfide bond를 끊기 때문이다. Protease 기능을 갖는 LC 도메인은 Zn 이온이 결합된 상태에서 SNARE(soluble NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) attachment protein receptors) 단백질에 대한 기질 특이성을 갖는다. BoNT/A, C, E 항원형의 경우 SNAP-25을 기질로, BoNT/B, D, F, G 항원형은 VAMP protein을 기질로, 추가적으로 BoNT/C는 syntaxin을 추가 기질로 하여 해당 단백질을 non-functional 하게 자른다. 기질로 target된 SNARE protein들이 신경전달물질의 이동에 기능하는 단백질들이기 때문에 BoNT가 일정 수준 이상 SNARE protein들을 자를 경우 신경전달이 이뤄지지 않아 이완성 마비가 유발된다.
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2.2. 보톡스 단백질 독소 개량
현재 의료 및 미용 목적으로 FDA에 승인된 보톡스는 항원형 A1과 B1이 유일하다. 의료 및 미용 목적으로 A1이 주로 이용되며, A1 항원형의 LC50가 kg 당 1ng이하라는 강력한 독성 때문에 의료 및 미용 목적으로 지속적으로 투여 받아도 단 기간 내에 면역되지 않는다. 다만, 장 기간 지속적으로 투여 받거나, 사고 등으로 일정 수준 이상의 보톡스에 노출될 경우, 면역 항체가 생성되어 더 이상 보톡스의 기대 효과를 볼 수 없거나 더 높은 수준의 투여량이 요구된다. 따라서 이와 같은 면역 등의 문제로 A1을 더 이상 사용할 수 없을 때에는 B1 등의 보톡스로 대체할 수 있지만 B1은 target receptor인 human synaptotagmin-II(Syt II)에 대한 결합 정도가 상대적으로 약하기 때문에 A1만큼의 강력한 효과를 기대하려면 60~100배의 단백질을 투여해야 한다. 그러나 더 많은 양의 단백질을 투여할 경우, 체내 비표적 조직 및 기관으로 확산되어 부작용을 유발하거나 면역을 더 촉진시키기 때문에 문제가 된다. 이를 해결하기 위해 Harvard Medical School의 Min Dong 교수 연구진은 B1 항원형의 receptor binding domain을 saturation mutagenesis를 진행한 후 bacterial adenylate cyclase two-hybrid method를 이용하여 스크리닝하여 human Syt II에 결합 강도가 11배 향상된 E1191M/S1199Y 돌연변이를 개발하였다[4]. 그리고 이 돌연변이를 이용할 경우, BoNT/A에 비해 B 항원형이 더 효과적으로 알려져 있는 질병들인 침 뒤흘림(sialorrhea), 다한증(hyperhidrosis) 등에 이용될 수 있을 것을 기대된다. 실제로 preclinical 동물 model에서 E1191M/S1199Y가 도입된 돌연변이 BoNT/B1가 A1에 비교될 만한 강한 마비 효과를 보임이 증명되었다[5].
수용체 결합 도메인에 대한 개량 연구가 결합도를 향상시키는 것에 주목한 반면, enzymatic domain (protease domain)에 대해서는 기질 특이성을 바꾸거나 체내 작용 기간을 조절하거나, 안정성을 향상시키는 방향으로 연구들이 진행되어 왔다. 대표적인 예로, Wisconsin 의대의 Joseph T. Barbieri 교수 연구진은 BoNT E1 항원형의 기질 특이성을 SNAP25와 더불어 SNAP23까지 확장시킴으로써 천식이나 염증성 질환과 같은 hypersecretion 질병을 완화하는 의료용 보톡스를 개발했다[6]. SNAP23는 비신경세포 단백질이나 BoNT/E1의 기존 기질인 SNAP25와의 구조 상동성이 높고, K224D 변이가 도입된 돌연변이 BoNT/E1의 SNAP25에 대한 기질 특이성 또한 유지되기 때문에 완전한 치료용 보톡스로는 한계점이 존재한다. 체내 작용 기간을 증가시킨 보고는 없지만 BoNT/A1의 C-terminus의 몇몇 잔기가 onset time 및 작용 기간을 조절한다는 사실에 기초하여 T420, F423, Y426, L429 잔기를 치환하여 야생형 대비 작용 기간이 짧지만 onset time은 빨라진 돌연변이를 개발한 사례도 보고되었다[7]. 이러한 보톡스의 경우, 단기적인 신경 마비가 요구되는 근육 경련 또는 골절 등에 응용될 수 있다. 이와는 별개로 A1 항원형의 LC domain의 산화적 안정성을 증가시킨 사례도 있다. 단백질 표면에 노출되어 있는 M106, M253, M411 잔기를 모두 leucine으로 치환한 돌연변이는 in vitro에서 산화적 안정성이 증가하였고, in vivo에서의 활성은 야생형과 동일했다[8]. 이 연구로부터 in vivo에서의 활성을 증가시키는 데에 있어서 LC domain의 산화적 안정성은 큰 영향이 없다는 사실을 확인할 수 있다. 아직 BoNT의 LC domain이 세포 내에서 어떻게 6개월 이상의 긴 지속 기간을 갖는지에 대한 정확한 이유는 규명되어 있지 않지만, 여러 선행 연구들에 의하면 VCIP135/VCPIP1에 의한 deubiquitination, septin과의 상호작용을 통한 membrane으로의 localization이 큰 이유로 생각되고 있다[9,10].
위에서 언급한 두 도메인들과는 달리 translocation domain의 경우 세포 내로의 translocation mechanism이 명확히 규명되지 않았기 때문에 개량 연구 또한 가장 더디다. 2013년에 독일의 Montecucco 및 Binz 그룹에서는 B1 항원형의 보톡스 표면에 있는 E48, E653, D877 잔기를 각각 음 전하를 띄지 않는 amide로 치환했을 때 더 빠른 translocation에 의한 빠른 onset time 효과를 보고한 바 있다[11]. 하지만 야생형과의 차이가 1.5배 이하로써 효용성 측면에서 유의미하다고 보기가 애매하며, 항원형 A1에 대해서는 그 효과가 입증되지 않았다. 반면, 2018년에 Nature communications에 보고된 논문에 이하면 translocation의 initiation이 E620-F667 잔기 부위에 의해서 조절됨이 밝혀졌는데, physiological 조건에서는 해당 부위가 alpha-helices bundle이었다가 산성 조건에서 표면으로 노출되는 소수성 beta-hairpin구조를 가지면서 translocation domain의 channel 형성을 촉진한다는 기작이 제시되었다. 정확한 translocation 기작이 규명됨에 따라 switch helice와 같은 특정 부위의 서열 최적화를 통해서 translocation 효율의 극대화가 가능할 것으로 보인다[12].
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2.3. 키메라 보톡스
키메라 보톡스란 보톡스의 본래 도메인을 다른 보톡스의 도메인으로 치환되어 자연계에 존재하지 않는 새로운 돌연변이 보톡스를 개발하는 방법이다. 자연적으로 발생한 키메라가 일부 발견되어 BoNT/DC, BoNT/FA (H) 등으로 명명되기도 했다. 일반적으로 LC-Hn을 한 도메인으로 묶고, Hc를 다른 보톡스의 것으로 치환하여 키메라 보톡스를 제작한다. 이미 예전부터 키메라 보톡스 개발이 연구 목적으로 많이 시도되어 왔으며, 현재까지 개발된 키메라 보톡스는 E-A, A-B 등의 항원형 등이 있다[13]. 다만, 아쉽게도 키메라 보톡스가 본래의 보톡스보다 in vivo 실험 조건에서 더 기능이 향상되었다는 보고는 없다. 다만, A-B chimera의 경우, in vitro 조건에서 A1 항원형보다 8배 향상된 독성을 나타낸다고 보고되었다. 보톡스의 알려진 항원형은 7개이고, 그 하위에 subtype 또한 존재하므로 훨씬 만은 키메라 보톡스 개발이 이론적으로 가능하지만, 모든 종류의 키메라 보톡스 개발이 어려운 것은 각 도메인 간 상호작용이 모두 달라서 non-functional한 보톡스가 개발될 수도 있으며, 아직 각 subtype 들에 대한 characterization이 덜 되었기 때문이기도 하다. 하지만 여전히 이와 같은 접근 방법은 보톡스의 도메인 별 기능을 이해하거나 새로운 보톡스를 개발하는 데에 유효하다.
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2.4. BoNT-like 독소 단백질
최근 들어 보톡스와 높은 상동성을 보이면서 박테리아 독소 단백질로 분류되는 단백질 중 새로운 항원형들이 Min Dong 교수 연구진을 필두로 하여 여러 연구진에 의해 보고되고 있다. 대표적으로 BoNT/X [14], BoNT/En [15], CP1 [16], PMP1 [17] 등이 있다. 특히, 주목할 만한 점은 새로운 toxin 단백질들은 Clostridium 이외의 genus에서도 발견되고 있으며, target host가 포유 동물이 아니라는 점이다. 대표적으로 PMP1의 경우, 모기나 파리와 같은 곤충에 특이적으로 결합하여 독성을 나타내는 것으로 알려졌다. 이와 같은 새로운 보톡스 유사 독소 단백질의 발견은 기존의 7개의 항원형으로 국한되어 있었던 보톡스의 범주를 보다 확대하여 보다 다양한 응용처에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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3. 결론-보톡스 개량의 숙제 및 추가 응용 분야
현재 FDA 승인이 되어 쓰이고 있는 BoNT/A1보다 체내에서 가장 잔존 기간이 길면서 더 유망한 보톡스는 개발되어 있지 않다. A 항원형 중 subtype으로 A2 또는 A6 등이 A1과 비슷하거나 onset time 측면에서 좀 더 향상된 효과를 보인다고 일부 보고되어 있지만 아직 임상으로 검증 되어있지 않았다. 또한, 세포막을 disruption하지 않고 세포질로 translocation하는 작용 기작은 아직 정확히 이해되지 못하고 있다. 이와 같은 숙제들을 풀기 위한 방법으로, 상기 언급했던 키메라 단백질의 개발 및 BoNT-like 단백질의 발견 등이 시도되고 있다. A 또는 B 항원형 이외의 항원형 중에서도 적절한 개량 연구 및 항원형 간의 키메라 단백질의 개발을 통해서 현재 항원형들의 대체제로 개발될 여지가 충분히 있을 것이다. 또한, 현재 가장 널리 쓰이는 A1 항원형의 비면역 돌연변이가 개발된다면 미래 의료용 보톡스 대체제로 주목받을 수 있으리라 생각된다.
추가적으로 보톡스를 단순히 그 기능을 유지하고 그 효능을 개량하는 수준의 연구를 넘어서 보톡스의 세포 침투 기능을 이용하여 원하는 외부 단백질을 세포 내로 전달하는 시도들이 보스턴을 중심으로 활발히 진행되고 있다. 세포 내로 원하는 단백질을 기능 손실 없이 전달하는 것 자체가 생명과학계에서 큰 숙제였기 때문에 해당 연구가 성공적으로 수행된다면 보톡스가 과학계에 기여하는 파급 효과가 대단히 클 것으로 생각된다.
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References
보튤라이늄 신경독소(Botulinum neurotoxin: Botox, 이하 보톡스)는 토양 미생물인 Clostridium botulinum에 의해 합성되는 단백질 독소로서 포유 동물의 신경 세포에 작용해 신경 세포 간 신경전달물질의 전달을 억제함으로써 이완성 마비(flaccid paralysis)를 유발한다. 보톡스는 매우 소량으로도 포유 동물에게 신경독을 나타낼 수 있으며 자연계에서는 주로 Clostridium botulinum에 오염된 음식을 섭취함으로써 체내에 유입되어 보튤리즘(botulism)을 야기한다. 지금까지 보고된 보톡스의 항원형은 7개(A to G)로 알려져 있으며, 대체로 반수 치사량이 kg당 ~1 ng 수준으로써 매우 높은 독성을 나타내기 때문에 생화학 무기로서 이용될 수 있다[1]. 또한, 소량의 보톡스가 이완성 마비를 유발하고 체내에서 최대 6개월까지 잔류 활성을 보인다는 특성을 이용해 희석액이 의료 및 미용 목적으로 이용되어 왔다. 최근에는 우울증이나 편두통, 당뇨로 유발된 실명 예방에도 보톡스의 임상 시험이 활발히 진행되고 있다. 이와 같은 보톡스의 응용은 점점 응용 분야가 넓어지고 있으며, 그에 따라 필요에 따른 단백질 변형 및 개발이 수행되고 있다. 본 보고서에서는 보톡스의 최근 개발 현황과 단백질 공학의 연구 동향에 대해서 소개한다.
2. 보톡스 단백질 독소 연구
2.1. 보톡스 단백질 독소의 구조 및 작용 기전
보톡스 단백질(BoNT)은 150 kDa의 비교적 큰 분자량을 갖는 single chain 단백질이다. 단백질 각 도메인의 기능에 따라 3개의 도메인으로 나뉘며, 이는 단백질 분해효소(protease) 도메인(light chain, LC), 세포질 전달(translocation) 도메인(N-terminal heavy chain, HN), 수용체 결합(receptor binding) 도메인(C-terminanl heavy chain, HC)으로 구성된다(그림 1). 보톡스가 신경세포(neuron)에 노출되면 수용체 결합 도메인이 뉴런 막단백질인 synaptic vesicle 2 protein 또는 synaptotagmin 특이적으로 결합한다. 이 때 뉴런 표면의 ganglioside의 당 moiety 또한 수용체 결합 도메인과 상호작용하여 결합 친화도에 영향을 준다고 알려져 있다[2]. 뉴런의 막에 선택적으로 붙은 보톡스는 내포 작용(endocytosis)에 의해 liposome으로 유입되며 liposome의 pH가 낮아짐에 따라 translocation 도메인의 특정 부위의 구조가 switch로 작용하여 liposome의 막에 pore를 형성하게 되고[3], 단백질 분해효소 도메인이 partial denaturation과정을 거쳐 뉴런의 세포질로 이동한 후 다시 functional한 분해효소로서 접힌다. 이 과정 중 단백질 분해효소 도메인이 세포질 전달 도메인으로부터 이탈할 수 있는 이유는 이 두 도메인을 잇는 loop가 체내 존재하는 다른 protease들에 의해 절단되고, liposome 내의 환원적 환경이 다시 한 번 두 도메인을 잇는 di-sulfide bond를 끊기 때문이다. Protease 기능을 갖는 LC 도메인은 Zn 이온이 결합된 상태에서 SNARE(soluble NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) attachment protein receptors) 단백질에 대한 기질 특이성을 갖는다. BoNT/A, C, E 항원형의 경우 SNAP-25을 기질로, BoNT/B, D, F, G 항원형은 VAMP protein을 기질로, 추가적으로 BoNT/C는 syntaxin을 추가 기질로 하여 해당 단백질을 non-functional 하게 자른다. 기질로 target된 SNARE protein들이 신경전달물질의 이동에 기능하는 단백질들이기 때문에 BoNT가 일정 수준 이상 SNARE protein들을 자를 경우 신경전달이 이뤄지지 않아 이완성 마비가 유발된다.
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2.2. 보톡스 단백질 독소 개량
현재 의료 및 미용 목적으로 FDA에 승인된 보톡스는 항원형 A1과 B1이 유일하다. 의료 및 미용 목적으로 A1이 주로 이용되며, A1 항원형의 LC50가 kg 당 1ng이하라는 강력한 독성 때문에 의료 및 미용 목적으로 지속적으로 투여 받아도 단 기간 내에 면역되지 않는다. 다만, 장 기간 지속적으로 투여 받거나, 사고 등으로 일정 수준 이상의 보톡스에 노출될 경우, 면역 항체가 생성되어 더 이상 보톡스의 기대 효과를 볼 수 없거나 더 높은 수준의 투여량이 요구된다. 따라서 이와 같은 면역 등의 문제로 A1을 더 이상 사용할 수 없을 때에는 B1 등의 보톡스로 대체할 수 있지만 B1은 target receptor인 human synaptotagmin-II(Syt II)에 대한 결합 정도가 상대적으로 약하기 때문에 A1만큼의 강력한 효과를 기대하려면 60~100배의 단백질을 투여해야 한다. 그러나 더 많은 양의 단백질을 투여할 경우, 체내 비표적 조직 및 기관으로 확산되어 부작용을 유발하거나 면역을 더 촉진시키기 때문에 문제가 된다. 이를 해결하기 위해 Harvard Medical School의 Min Dong 교수 연구진은 B1 항원형의 receptor binding domain을 saturation mutagenesis를 진행한 후 bacterial adenylate cyclase two-hybrid method를 이용하여 스크리닝하여 human Syt II에 결합 강도가 11배 향상된 E1191M/S1199Y 돌연변이를 개발하였다[4]. 그리고 이 돌연변이를 이용할 경우, BoNT/A에 비해 B 항원형이 더 효과적으로 알려져 있는 질병들인 침 뒤흘림(sialorrhea), 다한증(hyperhidrosis) 등에 이용될 수 있을 것을 기대된다. 실제로 preclinical 동물 model에서 E1191M/S1199Y가 도입된 돌연변이 BoNT/B1가 A1에 비교될 만한 강한 마비 효과를 보임이 증명되었다[5].
수용체 결합 도메인에 대한 개량 연구가 결합도를 향상시키는 것에 주목한 반면, enzymatic domain (protease domain)에 대해서는 기질 특이성을 바꾸거나 체내 작용 기간을 조절하거나, 안정성을 향상시키는 방향으로 연구들이 진행되어 왔다. 대표적인 예로, Wisconsin 의대의 Joseph T. Barbieri 교수 연구진은 BoNT E1 항원형의 기질 특이성을 SNAP25와 더불어 SNAP23까지 확장시킴으로써 천식이나 염증성 질환과 같은 hypersecretion 질병을 완화하는 의료용 보톡스를 개발했다[6]. SNAP23는 비신경세포 단백질이나 BoNT/E1의 기존 기질인 SNAP25와의 구조 상동성이 높고, K224D 변이가 도입된 돌연변이 BoNT/E1의 SNAP25에 대한 기질 특이성 또한 유지되기 때문에 완전한 치료용 보톡스로는 한계점이 존재한다. 체내 작용 기간을 증가시킨 보고는 없지만 BoNT/A1의 C-terminus의 몇몇 잔기가 onset time 및 작용 기간을 조절한다는 사실에 기초하여 T420, F423, Y426, L429 잔기를 치환하여 야생형 대비 작용 기간이 짧지만 onset time은 빨라진 돌연변이를 개발한 사례도 보고되었다[7]. 이러한 보톡스의 경우, 단기적인 신경 마비가 요구되는 근육 경련 또는 골절 등에 응용될 수 있다. 이와는 별개로 A1 항원형의 LC domain의 산화적 안정성을 증가시킨 사례도 있다. 단백질 표면에 노출되어 있는 M106, M253, M411 잔기를 모두 leucine으로 치환한 돌연변이는 in vitro에서 산화적 안정성이 증가하였고, in vivo에서의 활성은 야생형과 동일했다[8]. 이 연구로부터 in vivo에서의 활성을 증가시키는 데에 있어서 LC domain의 산화적 안정성은 큰 영향이 없다는 사실을 확인할 수 있다. 아직 BoNT의 LC domain이 세포 내에서 어떻게 6개월 이상의 긴 지속 기간을 갖는지에 대한 정확한 이유는 규명되어 있지 않지만, 여러 선행 연구들에 의하면 VCIP135/VCPIP1에 의한 deubiquitination, septin과의 상호작용을 통한 membrane으로의 localization이 큰 이유로 생각되고 있다[9,10].
위에서 언급한 두 도메인들과는 달리 translocation domain의 경우 세포 내로의 translocation mechanism이 명확히 규명되지 않았기 때문에 개량 연구 또한 가장 더디다. 2013년에 독일의 Montecucco 및 Binz 그룹에서는 B1 항원형의 보톡스 표면에 있는 E48, E653, D877 잔기를 각각 음 전하를 띄지 않는 amide로 치환했을 때 더 빠른 translocation에 의한 빠른 onset time 효과를 보고한 바 있다[11]. 하지만 야생형과의 차이가 1.5배 이하로써 효용성 측면에서 유의미하다고 보기가 애매하며, 항원형 A1에 대해서는 그 효과가 입증되지 않았다. 반면, 2018년에 Nature communications에 보고된 논문에 이하면 translocation의 initiation이 E620-F667 잔기 부위에 의해서 조절됨이 밝혀졌는데, physiological 조건에서는 해당 부위가 alpha-helices bundle이었다가 산성 조건에서 표면으로 노출되는 소수성 beta-hairpin구조를 가지면서 translocation domain의 channel 형성을 촉진한다는 기작이 제시되었다. 정확한 translocation 기작이 규명됨에 따라 switch helice와 같은 특정 부위의 서열 최적화를 통해서 translocation 효율의 극대화가 가능할 것으로 보인다[12].
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2.3. 키메라 보톡스
키메라 보톡스란 보톡스의 본래 도메인을 다른 보톡스의 도메인으로 치환되어 자연계에 존재하지 않는 새로운 돌연변이 보톡스를 개발하는 방법이다. 자연적으로 발생한 키메라가 일부 발견되어 BoNT/DC, BoNT/FA (H) 등으로 명명되기도 했다. 일반적으로 LC-Hn을 한 도메인으로 묶고, Hc를 다른 보톡스의 것으로 치환하여 키메라 보톡스를 제작한다. 이미 예전부터 키메라 보톡스 개발이 연구 목적으로 많이 시도되어 왔으며, 현재까지 개발된 키메라 보톡스는 E-A, A-B 등의 항원형 등이 있다[13]. 다만, 아쉽게도 키메라 보톡스가 본래의 보톡스보다 in vivo 실험 조건에서 더 기능이 향상되었다는 보고는 없다. 다만, A-B chimera의 경우, in vitro 조건에서 A1 항원형보다 8배 향상된 독성을 나타낸다고 보고되었다. 보톡스의 알려진 항원형은 7개이고, 그 하위에 subtype 또한 존재하므로 훨씬 만은 키메라 보톡스 개발이 이론적으로 가능하지만, 모든 종류의 키메라 보톡스 개발이 어려운 것은 각 도메인 간 상호작용이 모두 달라서 non-functional한 보톡스가 개발될 수도 있으며, 아직 각 subtype 들에 대한 characterization이 덜 되었기 때문이기도 하다. 하지만 여전히 이와 같은 접근 방법은 보톡스의 도메인 별 기능을 이해하거나 새로운 보톡스를 개발하는 데에 유효하다.
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2.4. BoNT-like 독소 단백질
최근 들어 보톡스와 높은 상동성을 보이면서 박테리아 독소 단백질로 분류되는 단백질 중 새로운 항원형들이 Min Dong 교수 연구진을 필두로 하여 여러 연구진에 의해 보고되고 있다. 대표적으로 BoNT/X [14], BoNT/En [15], CP1 [16], PMP1 [17] 등이 있다. 특히, 주목할 만한 점은 새로운 toxin 단백질들은 Clostridium 이외의 genus에서도 발견되고 있으며, target host가 포유 동물이 아니라는 점이다. 대표적으로 PMP1의 경우, 모기나 파리와 같은 곤충에 특이적으로 결합하여 독성을 나타내는 것으로 알려졌다. 이와 같은 새로운 보톡스 유사 독소 단백질의 발견은 기존의 7개의 항원형으로 국한되어 있었던 보톡스의 범주를 보다 확대하여 보다 다양한 응용처에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
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3. 결론-보톡스 개량의 숙제 및 추가 응용 분야
현재 FDA 승인이 되어 쓰이고 있는 BoNT/A1보다 체내에서 가장 잔존 기간이 길면서 더 유망한 보톡스는 개발되어 있지 않다. A 항원형 중 subtype으로 A2 또는 A6 등이 A1과 비슷하거나 onset time 측면에서 좀 더 향상된 효과를 보인다고 일부 보고되어 있지만 아직 임상으로 검증 되어있지 않았다. 또한, 세포막을 disruption하지 않고 세포질로 translocation하는 작용 기작은 아직 정확히 이해되지 못하고 있다. 이와 같은 숙제들을 풀기 위한 방법으로, 상기 언급했던 키메라 단백질의 개발 및 BoNT-like 단백질의 발견 등이 시도되고 있다. A 또는 B 항원형 이외의 항원형 중에서도 적절한 개량 연구 및 항원형 간의 키메라 단백질의 개발을 통해서 현재 항원형들의 대체제로 개발될 여지가 충분히 있을 것이다. 또한, 현재 가장 널리 쓰이는 A1 항원형의 비면역 돌연변이가 개발된다면 미래 의료용 보톡스 대체제로 주목받을 수 있으리라 생각된다.
추가적으로 보톡스를 단순히 그 기능을 유지하고 그 효능을 개량하는 수준의 연구를 넘어서 보톡스의 세포 침투 기능을 이용하여 원하는 외부 단백질을 세포 내로 전달하는 시도들이 보스턴을 중심으로 활발히 진행되고 있다. 세포 내로 원하는 단백질을 기능 손실 없이 전달하는 것 자체가 생명과학계에서 큰 숙제였기 때문에 해당 연구가 성공적으로 수행된다면 보톡스가 과학계에 기여하는 파급 효과가 대단히 클 것으로 생각된다.
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References
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- Strotmeier, J. et al. The biological activity of botulinum neurotoxin type C is dependent upon novel types of ganglioside binding sites. Molecular Microbiology, 81, 143-156, 2011.
- Rossetto, O. and Pirazzini, M. et al. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Reviews, 12, 535-549, 2014.
- Tao, L. et al. Engineered botulinum neurotoxin B with improved efficacy for targeting human receptors. Nature communications, 8, 53, 2017
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