나노자임의 특성과 최신연구 동향
2020-03-25
org.kosen.entty.User@1fab65f6
전영호(gulliver)
나노자임의 특성과 최신연구 동향
전영호, YoungJhon@gmail.com
서울시 난지물재생센터
Key words
nanozyme, enzyme, SOD, catalase, peroxidase, oxidase
나노자임, 효소, 항산화효소, 카탈라아제, 과산화효소, 산화효소
1. 서론
효소(enzyme)는 단백질이 대부분이고, 약간의 핵산이 섞인 조성의 생체 촉매(biocatalyst)이다. 이러한 효소는, 뛰어난 기질 특이성, 높은 촉매반응효율 등으로 인해, 식품, 의약품, 생물 산업 같은 다양한 분야에서 사용되고 있다. 효소의 종류로는, (1) 항산화효소(superoxide dismutase, SOD), (2) 카탈라아제(catalase), (3) 산화효소(oxidase), (4) 과산화효소(peroxidase) 등이 있다. 한편 활성산소(reactive oxygen species, ROS)는 화학적으로 반응성이 뛰어난 산소 원자 포함하는 분자를 말하는데, 초과산화물 라디칼(superoxide anion radical, O2-•), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 수산화기 라디칼(hydroxy radical) 등이 대표적인 ROS이다. 초과산화물은 주로 체내 호흡과정에서 생성되는데, 반응물의 0.2% ~ 1%가 물로 변화되지 않으면서 초과산화물이 된다. 이러한 활성산소는 적절히 제거되지 않으면, 신체의 다른 분자들과 쉽게 산화반응을 일으킬 수 있어서, 세포와 조직이 손상을 입게 된다. SOD는, 초과산화물 (superoxide, O2-•)을 물과 산소로 변화시키는 효소이며, 수소이온도 반응물로 같이 작용한다.
2O2-• + 2H+ à H2O + O2
카탈라아제는 과산화수소를 분해하여 물과 산소로 만드는 효소이며, 반응식은 다음과 같다.
2H2O2 à 2H2O + O2
과산화효소는, 과산화수소를 수소를 분해하여 물로 변화시키면서, 다른 기질(A)의 탈수소화 즉, 산화반응을 일으키는 효소이다.
H2O2 + 2AH à 2H2O + 2A
과산화효소의 대표적이 예로는, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP) 등이 있다. 항산화제(antioxidant)는 ROS를 제거하는 물질을 의미하는데, 카탈라아제와 과산화효소는, 과산화수소를 제거한다는 점에서, 모두 항산화제라고 할 수 있다. 산화효소는 물질의 산화반응에서 촉매작용을 하는 효소이다. 그림 1에 대표적인 효소와 그 대상 반응을 나타내었다.
그림 1. 대표적인 효소와 대상 반응의 예(참고문헌 3 변형).
이와 같은 효소는 많은 장점에도 불구하고, (1) 적절 온도, pH의 온화한 생물환경과 같아야 하는 엄격한 반응 조건, (2) 복잡한 제조 및 정제 공정, (3) 촉매의 낮은 안정성, (4) 낮은 안정성, (4) 특정한 3차원 구조를 형성하여야만 촉매활성을 유지할 수 있기 때문에 산도 및 온도 그리고 주변환경의 변화에 따라 활성도가 크게 변화한다는 점 등의 단점이 있어서, 산업화의 확장에 걸림돌이 되고 있다. 이러한 상황에서, 2007년에 최초로 Fe3O4 자기나노입자(magnetic nanoparticle, MNP)가 HRP 모방(mimetic) 과산화효소 촉매활성도를 보임이 보고 되고 나서부터 지금까지, 이러한 촉매특성을 가지는 나노입자(nanoparticle), 즉 나노자임(nanozyme)에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이러한 나노자임의 예로는, 산화세륨(CeO2) NP, 철산화물(Fe2O3, Fe3O4 등) NP, 금(Au) NP, 산화구리(CuO) NP, 산화바나듐(V2O5), 철 기반 하이브리드 NP(예: BiFeO3 NP, CoFe2O4 NP, Fe-S NP, Fe-Se NP), 그래핀 산화물(graphene oxide, GO) 등이 있다. 이 보고서에서는, 이러한 나노자임의 특성, 종류, 응용분야 등에 대하여 알아 보았다.
2. 나노자임의 특성, 종류 및 응용
2.1. 나노자임의 특성
나노자임은 효소 모방성을 가지는 나노무기화합물을 말하며, 천연 및 인공 효소에 비해, 효소 모방은 유지하면서도, (1) 높은 촉매활성 지속가능성, (2) 고온, 강산, 강염기 등의 가혹한 반응조건에서도 안정한 높은 내구성(robustness), (3) 대량 및 저가 합성이 가능함 (4) 생산물의 회수가능 등의 장점을 지니고 있다. 이러한 나노자임의 촉매활성은, 나노입자의 크기, 형태(morphology), 표면 상태 등에 의해 크게 변화될 수 있다. 예를 들면, Fe3O4 NP의 경우, 30, 150, 300 nm 입자크기 중에서, 30 nm와 300 nm 입자가 각각 가장 높고 가장 낮은 과산화효소 촉매활성을 보였으며, 이는 더 작은 NP가 기질에 더 용이하게 접근하고 표면적도 더 넓기 때문이다. 형태 면에서는, 깎은 정팔면체(truncated octahedron) Fe3O4 NP가 구형의 NP보다 촉매활성이 더 높았는데, 이는 NP의 결정면(facet)사이의 에너지 차이 때문이다. 또한, 나노자임의 중요한 특성 중의 하나는, 표면 기능기 도입(functionalization) 등을 통한 표면개질이 가능하다는 점이다. 예를 들면, Fe3O4 NP의 표면을 덱스트란(dextran) 으로 코팅하면, 생체 적합성(biocompatibility)이 있게 된다. 또한, 2,2’-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-술폰산 [ 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid, ABTS]와 3,5,3’,5’-테트라-메틸벤지딘 [3,5,3’,5’-tetra-methylbezidine, TMB]의 발색산화반응에서, Fe3O4 NP를, 글리신(glycine), 폴리라이신(polylysine), 폴리(에틸렌이민) [ poly(ethyleneimine) ]으로 표면 개질하여 양전하를 띠게 하거나, 또는 구연산(citrate), 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran), 헤파린(heparin)으로 표면개질하여 음전하를 띠게 하면 각각, 음이온성인 ABTS의 발색 산화반응 또는 양이온성인 TMB의 발색산화반응에, 더 향상된 촉매 활성을 보였다.
2.2. 나노자임의 종류와 응용
모방하는 효소의 종류에 따라 나노자임을 분류하면, 대개 (1) SOD 모방-, (2) 카탈라아제 모방-, (3) 산화효소 모방-, (4) 과산화효소 모방- 나노자임으로 나뉘며, 나노자임의 예와 그 응용은 다음과 같다.
SOD 모방 나노자임 : 높은 Ce3+/Ce4+ 비율을 가지는 CeO2 NP는 대표적인 SOD 모방 나노자임으로알려져 있다. 이러한 CeO2 NP의 초과산화물 제거능은 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance) 측정으로 확인되었으며, 다음과 같은 반응경로가 제시되었다.
O2-• + Ce4+ à O2 + Ce3+
O2-• + Ce3+ + 2H+ à H2O2 + Ce4+
위 반응식에서, 이 공정이 Ce3+가 Ce4+의 산화반응으로부터 재생되는 자체-재생공정(auto-regeneration)임을 알 수 있으며, 보통 며칠 내에 CeO2 NP가 완전히 재생되어, 다시 다른 초과산화물의 촉매로 작용할 수 있다. 선행연구에 의하면, 3-5 nm의 CeO2 NP가 원 CuZn SOD보다 더 높은 촉매활성을 보였는바, 반응속도상수가 각각 3.6×109 M-1s-1, 1.3-2.8×109 M-1s-1이었다. 그 밖에, 풀러렌과 그 유도체도 SOD 모방 촉매활성을 보이지만, 원 SOD에 비해서는 반응속도가 100배 더 느리다고 보고되었다.
카탈라아제 모방 나노자임 : 세포질(cytoplasm)에서 과산화수소는, 생물학적신호처리와 더 반응성이 높은 수산화기 라디칼을 생성한다는 점에서, 더 안정적인 화합물이라고 할 수도 있다. 하지만, 전이금소이온 존재 하에서 과산화수소는 Fenton 반응을 통해 반응성이 큰 수산화기 라디칼을 생성하기 때문에, 세포질 내의 과도한 과산화수소는 반드시 물과 산소로 분해되어야 한다. 생체 내에서 카탈라아제는 이러한 반응의 촉매로 작용한다. 카탈라아제 모방 나노자임으로는, 낮은 Ce3+/Ce4+ 비율을 가지는 CeO2 NP, 철산화물(예: Fe2O3, Fe3O4) NP, Au NP, 코발트산화물 등이 있다. 특히 Au NP는 낮은 세포독성(cytotoxicity), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) [플라스몬 : 금속 내부에서 동시에 진동하는 전자들] 이 있어서 생화학 분야에서의 유망한 효소작용물질로 간주되고 있다. 선행연구 결과, 카탈라아제 모방 CeO2 NP 는 생물학적으로 관련있는 완충용액(buffer)에 분산시켰을 때에도, 견고성(robustness)을 유지하였으며, 촉매 활성이 감소되지 않았다. 이러한 카탈라아제 모방CeO2 NP의 반응식은 다음과 같이 표현될 수 있다.
2H2O2 + Ce4+ à 2H2 + O2 + Ce3+
또한, 신경독성(neurotoxic) 유기포스페이트(organophosphate)같은 독성 생물작용제(biological agent) [자연적으로 존재하거나 유전자를 변형하여 만들어진 것으로 인간 또는 동물, 식물에게 사망, 고사, 질병, 일시적 무능화 또는 영구적 상해를 유발하는 미생물이나 바이러스]를 가수분해하는 가수분해용 나노자임은 거의 알려져 있지 않은데, 지르코늄-도입(Zr-incorporated) CeO2 NP가, 신경 작용제(nerve agent) [흡입 또는 피부 접촉 시 주로 자율 신경 계통인 교감 신경과 부교감 신경의 균형을 파괴함으로써 단시간 내에 사망하게 하는 급속 살상 작용제] 의 일종인 메틸 파라옥손(methyl paraoxon)을 독성이 덜한 모노에스테르 화합물로 효율적으로 가수분해한다고 보고되었다.
산화효소 모방 나노자임 : 천연 산화효소는 산소를 전자 받개(electron acceptor)로 하여, 기질을 산화시키는 반응의 촉매로 작용하며, 이어서, 산소는 물 또는 과산화 수소로 환원된다. 앞에서, 높은 Ce3+/Ce4+ 비율과 낮은 Ce3+/Ce4+ 비율의 CeO2 NP가 각각 SOD-와 카탈라아제- 모방 나노자임으로 작용함을 알았다. 선행연구에 의하면, 이와는 달리, 덱스트란-코팅 CeO2 NP는 생체 적합성과 더불어 산화효소 모방 촉매활성을 가진다고 보고되었으며, 과산화수소가 없는 산성 pH 조건 하에서, 발색성 기질(colorimetric substrate)인 ABTS, TMB, 그리고 L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)를 산화시켰다. 또한, 이러한 산화효소 모방 CeO2 NP의 촉매활성은 pH와 크기, 덱스트란 코팅 두께에 의존하며, HRP에 비해 더 빠른 반응속도상수(CeO2 NP : 1-7 ×10-7 M-1s-1, HRP : 1×10-8 M-1s-1)를 가짐을 알 수 있었다. 그밖에, Fe2O3 나노와이어(nanowire)가 포도당 산화반응에서, 산화효소 모방 촉매활성을 가진다고 보고되었다. 다른 선형연구 결과, 구연산 캡핑(citrate-capped) Au NP도, 원 효소에 비해 약55배 낮기는 하지만, 산화효소 모방 촉매활성을 보여, 포도당(glucose)을 호기성 산화시켰다. 반면에, 이 때 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 팔라듐(Pd)같은 금속성 NP는 상당한(significant) 산화효소 모방 촉매활성을 보이지 않았다.
과산화효소 모방 나노자임 : 천연 과산화효소는 많은 종류가 있으며 대표적인 물질로는 HRP가 있다. 이러한 천연 과산화효소는 주로 기질을 탈수소화, 즉 산화시키기 위해, 과산화수소를 이용한다. 또한, 글루타티온(glutathione) 과산화효소 같은 과산화효소는, 자유 라디칼을 비독성화(detoxifying)하는 작용을 한다. 과산화효소 모방 나노자임의 대표적인 예로는, Fe3O4 NP이 있으며, 그 밖에, Fe-S NP, FeTe NP, CuS NP, Au NP, 그리고 V2O5 NP 등이 있다. 선행연구 결과에 의하면, Fe3O4 NP의 기질 친화도(154 mM)가 HRP의 기질 친화도(3.7 mM)보다 더 강하며, 같은 몰 농도에서 Fe3O4 NP 촉매 활성도가 HRP의 활성도보다 약 40배 더 높았다. 일반적으로, 과산화효소의 과산화수소 분해반응은 두 가지 기질, 즉, 과산화수소와 탈수소화가 일어나게 될 수소 주개(hydrogen donor)가 필요하다. (1) 여기서 수소 주개로, 산화 시 무색에서 특정한 색으로 변하는 발색시약물질인 TMB와 ABTES를 사용하면, 과산화효소를 통해 과산화수소의 유무와 존재량에 대한 감지가 가능하다. 또한, (2) 과산화수소를 생성할 수 있는 화합물(예: 산화효소에 의한 기질의 산화와 이에 따른 산소의 과산화수소로의 환원)이 있는 경우, 이 과산화수소 생성반응과 앞의 반응을 조합하여, 이러한 화합물의 감지가 가능하다. 예를 들면, 포도당 산화효소(glucose oxidase, GOx)에 의한 포도당(glucose)의 글루콘산(gluconic acid)로의 산화반응 및 이에 따른 산소의 과산화수소로의 환원반응과, 과산화효소 모방 나노자임을 사용한 발색반응을 조합하여 포도당의 감지 플랫폼 형성이 가능하다(그림2 참조). 이렇게 제조된 감지 폴랫폼은, 0.5 μM의 검출한계(limit of detection, LOD)로 포도당 농도를 감지하여, 당뇨병 진단용 혈당 측정키트로 사용할 수도 있다.
그림 2. (a) 포도당 산화효소와 나노자임을 사용한 포도당의 발색 감지
(b) 산화효소와 나노자임을 사용한 기질의 발색 감지 (참고문헌 2 변형).
그밖에, (3) 항체(antibody) 또는 항원(antigen)에 과산화효소를 부착하고, 항원항체 면역반응이 일어난 후, 시스템을 워시하여 다른 부분을 씻어낸 다음, 과산화수소와 발색시약화합물 기질을 첨가하여 반응이 일어나게 함으로써 발색을 통하여 각각 항원 또는 항체의 존재 유무와 존재량을 알 수 있다. 이러한 방법을 효소면역측정법(enzyme–linked immunosorbent assay, ELISA)이라고 하며, 그림 3에 ELISA의 일종인, 포획 항체(capture antibody)와 감지 항체(detection antibody)를 사용하는 Sandwich ELISA의 공정 절차에 대하여 나타내었다. 이러한 세 가지 감지 방법에서 과산화효소 대신 과산화효소 모방 나노자임을 사용할 수 있으며, 이를 통해 더 효율적이고 안정적인 감지 시스템 형성이 가능하다.
그림 3. Sandwich ELISA 공정 (참고문헌 11 변형).
3. 그 밖의 나노자임 및 응용
프러시안 블루 나노입자(Prussian blue nanoparticle, PBNP)는, 과산화효소, 카탈라아제, 그리고 SOD의 다중 효소모방 물성을 가진다고 보고되었다. [Fe2(CN)6]– 의 화학식을 가지는 프러시안 블루는, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)을 안정제(stabilizer)로 하여, PBNP를 형성할 수 있다. 이러한 PBNP는 과산화수소 존재 하에서, 약 pH 4.0 에서 과산화수소를 물로 변화시킴과 동시에 TMB와 ABTS를 탈수소화, 즉 산화시킬 수 있으며, 이러한 과산화효소 모방 촉매활성은 Fe3O4 NP보다 높다고 알려져 있다. PBNP의 과산화효소 모방 촉매활성은, pH가 산성에서 중성으로 변화함에 따라, 카탈아제 모방 촉매활성으로 바뀌며, 물과 산소가 생성된다. 또한, 몇몇 서로 다른 pH에서는 PBNP가 SOD 모방 촉매활성을 보였다. 한편, 압타머(aptamer)는 특정물질에 결합하는 특성을 가지는 생체고분자를 지칭하며, RNA, 펩티드(peptide) 등으로 구성된다. 이러한 압타머는, 독특한 2차원 또는 3차원 구조를 형성하여, 비결합 상호작용을 통해, 동종의(cognate) 목적(target)물질과 결합한다. 그러므로, 압타머와 나노자임의 조합은 나노자임-기반 압타센서(aptasensor)로 작동할 수 있으며, 이에 대한 바이오센서 연구가 활발히 이루어 지고 있다.
4. 결론
나노자임은, 무기물질이 단백질로 구성되는 효소와 같은 촉매활성을 보인다는 점에서도 매우 흥미롭지만, 촉매활성의 지속성, 고온 또는 강산, 강염기의 가혹한 조건이 가능함, 낮은 가격 등의 장점을 지니고 있어서, 최근 각광 받고 있으며, 널리 연구 및 상용화가 이루어지고 있다. 본 보고서에서는 이러한 나노자임의 정의와 물성, 종류, 그리고 그 응용에 대하여 알아 보았다.
References
전영호, YoungJhon@gmail.com
서울시 난지물재생센터
Key words
nanozyme, enzyme, SOD, catalase, peroxidase, oxidase
나노자임, 효소, 항산화효소, 카탈라아제, 과산화효소, 산화효소
1. 서론
효소(enzyme)는 단백질이 대부분이고, 약간의 핵산이 섞인 조성의 생체 촉매(biocatalyst)이다. 이러한 효소는, 뛰어난 기질 특이성, 높은 촉매반응효율 등으로 인해, 식품, 의약품, 생물 산업 같은 다양한 분야에서 사용되고 있다. 효소의 종류로는, (1) 항산화효소(superoxide dismutase, SOD), (2) 카탈라아제(catalase), (3) 산화효소(oxidase), (4) 과산화효소(peroxidase) 등이 있다. 한편 활성산소(reactive oxygen species, ROS)는 화학적으로 반응성이 뛰어난 산소 원자 포함하는 분자를 말하는데, 초과산화물 라디칼(superoxide anion radical, O2-•), 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2), 수산화기 라디칼(hydroxy radical) 등이 대표적인 ROS이다. 초과산화물은 주로 체내 호흡과정에서 생성되는데, 반응물의 0.2% ~ 1%가 물로 변화되지 않으면서 초과산화물이 된다. 이러한 활성산소는 적절히 제거되지 않으면, 신체의 다른 분자들과 쉽게 산화반응을 일으킬 수 있어서, 세포와 조직이 손상을 입게 된다. SOD는, 초과산화물 (superoxide, O2-•)을 물과 산소로 변화시키는 효소이며, 수소이온도 반응물로 같이 작용한다.
2O2-• + 2H+ à H2O + O2
카탈라아제는 과산화수소를 분해하여 물과 산소로 만드는 효소이며, 반응식은 다음과 같다.
2H2O2 à 2H2O + O2
과산화효소는, 과산화수소를 수소를 분해하여 물로 변화시키면서, 다른 기질(A)의 탈수소화 즉, 산화반응을 일으키는 효소이다.
H2O2 + 2AH à 2H2O + 2A
과산화효소의 대표적이 예로는, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase, HRP) 등이 있다. 항산화제(antioxidant)는 ROS를 제거하는 물질을 의미하는데, 카탈라아제와 과산화효소는, 과산화수소를 제거한다는 점에서, 모두 항산화제라고 할 수 있다. 산화효소는 물질의 산화반응에서 촉매작용을 하는 효소이다. 그림 1에 대표적인 효소와 그 대상 반응을 나타내었다.
그림 1. 대표적인 효소와 대상 반응의 예(참고문헌 3 변형).
이와 같은 효소는 많은 장점에도 불구하고, (1) 적절 온도, pH의 온화한 생물환경과 같아야 하는 엄격한 반응 조건, (2) 복잡한 제조 및 정제 공정, (3) 촉매의 낮은 안정성, (4) 낮은 안정성, (4) 특정한 3차원 구조를 형성하여야만 촉매활성을 유지할 수 있기 때문에 산도 및 온도 그리고 주변환경의 변화에 따라 활성도가 크게 변화한다는 점 등의 단점이 있어서, 산업화의 확장에 걸림돌이 되고 있다. 이러한 상황에서, 2007년에 최초로 Fe3O4 자기나노입자(magnetic nanoparticle, MNP)가 HRP 모방(mimetic) 과산화효소 촉매활성도를 보임이 보고 되고 나서부터 지금까지, 이러한 촉매특성을 가지는 나노입자(nanoparticle), 즉 나노자임(nanozyme)에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이러한 나노자임의 예로는, 산화세륨(CeO2) NP, 철산화물(Fe2O3, Fe3O4 등) NP, 금(Au) NP, 산화구리(CuO) NP, 산화바나듐(V2O5), 철 기반 하이브리드 NP(예: BiFeO3 NP, CoFe2O4 NP, Fe-S NP, Fe-Se NP), 그래핀 산화물(graphene oxide, GO) 등이 있다. 이 보고서에서는, 이러한 나노자임의 특성, 종류, 응용분야 등에 대하여 알아 보았다.
2. 나노자임의 특성, 종류 및 응용
2.1. 나노자임의 특성
나노자임은 효소 모방성을 가지는 나노무기화합물을 말하며, 천연 및 인공 효소에 비해, 효소 모방은 유지하면서도, (1) 높은 촉매활성 지속가능성, (2) 고온, 강산, 강염기 등의 가혹한 반응조건에서도 안정한 높은 내구성(robustness), (3) 대량 및 저가 합성이 가능함 (4) 생산물의 회수가능 등의 장점을 지니고 있다. 이러한 나노자임의 촉매활성은, 나노입자의 크기, 형태(morphology), 표면 상태 등에 의해 크게 변화될 수 있다. 예를 들면, Fe3O4 NP의 경우, 30, 150, 300 nm 입자크기 중에서, 30 nm와 300 nm 입자가 각각 가장 높고 가장 낮은 과산화효소 촉매활성을 보였으며, 이는 더 작은 NP가 기질에 더 용이하게 접근하고 표면적도 더 넓기 때문이다. 형태 면에서는, 깎은 정팔면체(truncated octahedron) Fe3O4 NP가 구형의 NP보다 촉매활성이 더 높았는데, 이는 NP의 결정면(facet)사이의 에너지 차이 때문이다. 또한, 나노자임의 중요한 특성 중의 하나는, 표면 기능기 도입(functionalization) 등을 통한 표면개질이 가능하다는 점이다. 예를 들면, Fe3O4 NP의 표면을 덱스트란(dextran) 으로 코팅하면, 생체 적합성(biocompatibility)이 있게 된다. 또한, 2,2’-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-술폰산 [ 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline)-6-sulfonic acid, ABTS]와 3,5,3’,5’-테트라-메틸벤지딘 [3,5,3’,5’-tetra-methylbezidine, TMB]의 발색산화반응에서, Fe3O4 NP를, 글리신(glycine), 폴리라이신(polylysine), 폴리(에틸렌이민) [ poly(ethyleneimine) ]으로 표면 개질하여 양전하를 띠게 하거나, 또는 구연산(citrate), 카복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran), 헤파린(heparin)으로 표면개질하여 음전하를 띠게 하면 각각, 음이온성인 ABTS의 발색 산화반응 또는 양이온성인 TMB의 발색산화반응에, 더 향상된 촉매 활성을 보였다.
2.2. 나노자임의 종류와 응용
모방하는 효소의 종류에 따라 나노자임을 분류하면, 대개 (1) SOD 모방-, (2) 카탈라아제 모방-, (3) 산화효소 모방-, (4) 과산화효소 모방- 나노자임으로 나뉘며, 나노자임의 예와 그 응용은 다음과 같다.
SOD 모방 나노자임 : 높은 Ce3+/Ce4+ 비율을 가지는 CeO2 NP는 대표적인 SOD 모방 나노자임으로알려져 있다. 이러한 CeO2 NP의 초과산화물 제거능은 전자 상자성 공명(electron paramagnetic resonance) 측정으로 확인되었으며, 다음과 같은 반응경로가 제시되었다.
O2-• + Ce4+ à O2 + Ce3+
O2-• + Ce3+ + 2H+ à H2O2 + Ce4+
위 반응식에서, 이 공정이 Ce3+가 Ce4+의 산화반응으로부터 재생되는 자체-재생공정(auto-regeneration)임을 알 수 있으며, 보통 며칠 내에 CeO2 NP가 완전히 재생되어, 다시 다른 초과산화물의 촉매로 작용할 수 있다. 선행연구에 의하면, 3-5 nm의 CeO2 NP가 원 CuZn SOD보다 더 높은 촉매활성을 보였는바, 반응속도상수가 각각 3.6×109 M-1s-1, 1.3-2.8×109 M-1s-1이었다. 그 밖에, 풀러렌과 그 유도체도 SOD 모방 촉매활성을 보이지만, 원 SOD에 비해서는 반응속도가 100배 더 느리다고 보고되었다.
카탈라아제 모방 나노자임 : 세포질(cytoplasm)에서 과산화수소는, 생물학적신호처리와 더 반응성이 높은 수산화기 라디칼을 생성한다는 점에서, 더 안정적인 화합물이라고 할 수도 있다. 하지만, 전이금소이온 존재 하에서 과산화수소는 Fenton 반응을 통해 반응성이 큰 수산화기 라디칼을 생성하기 때문에, 세포질 내의 과도한 과산화수소는 반드시 물과 산소로 분해되어야 한다. 생체 내에서 카탈라아제는 이러한 반응의 촉매로 작용한다. 카탈라아제 모방 나노자임으로는, 낮은 Ce3+/Ce4+ 비율을 가지는 CeO2 NP, 철산화물(예: Fe2O3, Fe3O4) NP, Au NP, 코발트산화물 등이 있다. 특히 Au NP는 낮은 세포독성(cytotoxicity), 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) [플라스몬 : 금속 내부에서 동시에 진동하는 전자들] 이 있어서 생화학 분야에서의 유망한 효소작용물질로 간주되고 있다. 선행연구 결과, 카탈라아제 모방 CeO2 NP 는 생물학적으로 관련있는 완충용액(buffer)에 분산시켰을 때에도, 견고성(robustness)을 유지하였으며, 촉매 활성이 감소되지 않았다. 이러한 카탈라아제 모방CeO2 NP의 반응식은 다음과 같이 표현될 수 있다.
2H2O2 + Ce4+ à 2H2 + O2 + Ce3+
또한, 신경독성(neurotoxic) 유기포스페이트(organophosphate)같은 독성 생물작용제(biological agent) [자연적으로 존재하거나 유전자를 변형하여 만들어진 것으로 인간 또는 동물, 식물에게 사망, 고사, 질병, 일시적 무능화 또는 영구적 상해를 유발하는 미생물이나 바이러스]를 가수분해하는 가수분해용 나노자임은 거의 알려져 있지 않은데, 지르코늄-도입(Zr-incorporated) CeO2 NP가, 신경 작용제(nerve agent) [흡입 또는 피부 접촉 시 주로 자율 신경 계통인 교감 신경과 부교감 신경의 균형을 파괴함으로써 단시간 내에 사망하게 하는 급속 살상 작용제] 의 일종인 메틸 파라옥손(methyl paraoxon)을 독성이 덜한 모노에스테르 화합물로 효율적으로 가수분해한다고 보고되었다.
산화효소 모방 나노자임 : 천연 산화효소는 산소를 전자 받개(electron acceptor)로 하여, 기질을 산화시키는 반응의 촉매로 작용하며, 이어서, 산소는 물 또는 과산화 수소로 환원된다. 앞에서, 높은 Ce3+/Ce4+ 비율과 낮은 Ce3+/Ce4+ 비율의 CeO2 NP가 각각 SOD-와 카탈라아제- 모방 나노자임으로 작용함을 알았다. 선행연구에 의하면, 이와는 달리, 덱스트란-코팅 CeO2 NP는 생체 적합성과 더불어 산화효소 모방 촉매활성을 가진다고 보고되었으며, 과산화수소가 없는 산성 pH 조건 하에서, 발색성 기질(colorimetric substrate)인 ABTS, TMB, 그리고 L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)를 산화시켰다. 또한, 이러한 산화효소 모방 CeO2 NP의 촉매활성은 pH와 크기, 덱스트란 코팅 두께에 의존하며, HRP에 비해 더 빠른 반응속도상수(CeO2 NP : 1-7 ×10-7 M-1s-1, HRP : 1×10-8 M-1s-1)를 가짐을 알 수 있었다. 그밖에, Fe2O3 나노와이어(nanowire)가 포도당 산화반응에서, 산화효소 모방 촉매활성을 가진다고 보고되었다. 다른 선형연구 결과, 구연산 캡핑(citrate-capped) Au NP도, 원 효소에 비해 약55배 낮기는 하지만, 산화효소 모방 촉매활성을 보여, 포도당(glucose)을 호기성 산화시켰다. 반면에, 이 때 은(Ag), 구리(Cu), 백금(Pt), 팔라듐(Pd)같은 금속성 NP는 상당한(significant) 산화효소 모방 촉매활성을 보이지 않았다.
과산화효소 모방 나노자임 : 천연 과산화효소는 많은 종류가 있으며 대표적인 물질로는 HRP가 있다. 이러한 천연 과산화효소는 주로 기질을 탈수소화, 즉 산화시키기 위해, 과산화수소를 이용한다. 또한, 글루타티온(glutathione) 과산화효소 같은 과산화효소는, 자유 라디칼을 비독성화(detoxifying)하는 작용을 한다. 과산화효소 모방 나노자임의 대표적인 예로는, Fe3O4 NP이 있으며, 그 밖에, Fe-S NP, FeTe NP, CuS NP, Au NP, 그리고 V2O5 NP 등이 있다. 선행연구 결과에 의하면, Fe3O4 NP의 기질 친화도(154 mM)가 HRP의 기질 친화도(3.7 mM)보다 더 강하며, 같은 몰 농도에서 Fe3O4 NP 촉매 활성도가 HRP의 활성도보다 약 40배 더 높았다. 일반적으로, 과산화효소의 과산화수소 분해반응은 두 가지 기질, 즉, 과산화수소와 탈수소화가 일어나게 될 수소 주개(hydrogen donor)가 필요하다. (1) 여기서 수소 주개로, 산화 시 무색에서 특정한 색으로 변하는 발색시약물질인 TMB와 ABTES를 사용하면, 과산화효소를 통해 과산화수소의 유무와 존재량에 대한 감지가 가능하다. 또한, (2) 과산화수소를 생성할 수 있는 화합물(예: 산화효소에 의한 기질의 산화와 이에 따른 산소의 과산화수소로의 환원)이 있는 경우, 이 과산화수소 생성반응과 앞의 반응을 조합하여, 이러한 화합물의 감지가 가능하다. 예를 들면, 포도당 산화효소(glucose oxidase, GOx)에 의한 포도당(glucose)의 글루콘산(gluconic acid)로의 산화반응 및 이에 따른 산소의 과산화수소로의 환원반응과, 과산화효소 모방 나노자임을 사용한 발색반응을 조합하여 포도당의 감지 플랫폼 형성이 가능하다(그림2 참조). 이렇게 제조된 감지 폴랫폼은, 0.5 μM의 검출한계(limit of detection, LOD)로 포도당 농도를 감지하여, 당뇨병 진단용 혈당 측정키트로 사용할 수도 있다.
그림 2. (a) 포도당 산화효소와 나노자임을 사용한 포도당의 발색 감지
(b) 산화효소와 나노자임을 사용한 기질의 발색 감지 (참고문헌 2 변형).
그밖에, (3) 항체(antibody) 또는 항원(antigen)에 과산화효소를 부착하고, 항원항체 면역반응이 일어난 후, 시스템을 워시하여 다른 부분을 씻어낸 다음, 과산화수소와 발색시약화합물 기질을 첨가하여 반응이 일어나게 함으로써 발색을 통하여 각각 항원 또는 항체의 존재 유무와 존재량을 알 수 있다. 이러한 방법을 효소면역측정법(enzyme–linked immunosorbent assay, ELISA)이라고 하며, 그림 3에 ELISA의 일종인, 포획 항체(capture antibody)와 감지 항체(detection antibody)를 사용하는 Sandwich ELISA의 공정 절차에 대하여 나타내었다. 이러한 세 가지 감지 방법에서 과산화효소 대신 과산화효소 모방 나노자임을 사용할 수 있으며, 이를 통해 더 효율적이고 안정적인 감지 시스템 형성이 가능하다.
그림 3. Sandwich ELISA 공정 (참고문헌 11 변형).
3. 그 밖의 나노자임 및 응용
프러시안 블루 나노입자(Prussian blue nanoparticle, PBNP)는, 과산화효소, 카탈라아제, 그리고 SOD의 다중 효소모방 물성을 가진다고 보고되었다. [Fe2(CN)6]– 의 화학식을 가지는 프러시안 블루는, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP)을 안정제(stabilizer)로 하여, PBNP를 형성할 수 있다. 이러한 PBNP는 과산화수소 존재 하에서, 약 pH 4.0 에서 과산화수소를 물로 변화시킴과 동시에 TMB와 ABTS를 탈수소화, 즉 산화시킬 수 있으며, 이러한 과산화효소 모방 촉매활성은 Fe3O4 NP보다 높다고 알려져 있다. PBNP의 과산화효소 모방 촉매활성은, pH가 산성에서 중성으로 변화함에 따라, 카탈아제 모방 촉매활성으로 바뀌며, 물과 산소가 생성된다. 또한, 몇몇 서로 다른 pH에서는 PBNP가 SOD 모방 촉매활성을 보였다. 한편, 압타머(aptamer)는 특정물질에 결합하는 특성을 가지는 생체고분자를 지칭하며, RNA, 펩티드(peptide) 등으로 구성된다. 이러한 압타머는, 독특한 2차원 또는 3차원 구조를 형성하여, 비결합 상호작용을 통해, 동종의(cognate) 목적(target)물질과 결합한다. 그러므로, 압타머와 나노자임의 조합은 나노자임-기반 압타센서(aptasensor)로 작동할 수 있으며, 이에 대한 바이오센서 연구가 활발히 이루어 지고 있다.
4. 결론
나노자임은, 무기물질이 단백질로 구성되는 효소와 같은 촉매활성을 보인다는 점에서도 매우 흥미롭지만, 촉매활성의 지속성, 고온 또는 강산, 강염기의 가혹한 조건이 가능함, 낮은 가격 등의 장점을 지니고 있어서, 최근 각광 받고 있으며, 널리 연구 및 상용화가 이루어지고 있다. 본 보고서에서는 이러한 나노자임의 정의와 물성, 종류, 그리고 그 응용에 대하여 알아 보았다.
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