CRISPR/Cas9 기반 유전자 편집 도구와 유전자 치료에의 적용
2021-09-08
org.kosen.entty.User@64a07acd
정선민(sakura8528)
1. 개요
세상에 존재하는 다양한 질병들 중에서 상당수가 유전적인 원인으로 발병하는 것으로 잘 알려져 있다. 유전적으로 발병하는 질병들은 특정 유전자에 변이 혹은 소실로 인해서 세포 내 특정 단백질이 제 기능을 못하거나 이상 기능을 발현함으로 인해서 발생한다. 유전적인 원인으로 발병하는 질병은 전세계적으로 태어나는 신생아를 기준으로 하였을 때 2-5%를 차지하며 그 중에서 50%는 오래 살지 못하고 죽는 것으로 알려져 있다.
유전자 편집 및 유전자 치료는 최근 몇 년 동안 연구분야에서 매우 각광받고 있는 기술이다. 유전자의 특정 부분을 변형하여 유전자 정보를 편집하고 이를 통해 질병을 치료하는 방법은 질병의 종류에 관계없이 유전자 변형에 의한 질병이라면 어디에든 적용가능하기 때문에 매우 효율성이 높은 기술이다. 유전자를 편집하는 방법들 중에서 CRISPR/Cas system은 질병 치료에 적용될 수 있을 정도로 매우 효율적이고 간편하다. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)은 E.coli에서 최초로 발견되었으며, 이후 다양한 박테리아에서도 보고되기 시작하였다. CRISPR/Cas system은 외부에서 들어온 DNA를 인지하고 죽이기 위한 원핵생물에서의 면역반응이다 [1]. CRISPR와 함께 관련 단백질로 Cas 단백질이 발견되었으며, 이는 후천면역과 관련된 단백질로 알려져 있다. 이 기술은 DNA와 RNA 모두에서 적용이 가능하다. Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) 및 zinc-finger nucleases (ZFNs)와 같은 다른 유전자 편집 기술보다 더 정확하고 쉬우며 연구에서도 빠르게 발전하고 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 외부로부터 들어온 DNA/RNA 내 특정 서열을 인지하고 절단한다. 이를 이용한 방법은 원하는 부분을 직접 잘라내고 삽입할 수 있으며, 이를 통해서 유전정보를 편집하여 질병을 유발하는 유전자나 특정 기능을 향상시킬 수 있다. 최근까지의 개발 동향을 살펴보면, 이러한 편집 기술들은 실제로 치료방법으로서의 무궁한 가능성을 가지고 있으며, 실제로 적용이 가능하지 연구가 다양한 질병연구에서 진행 중에 있다. 따라서 본 리포트에서는 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술의 원리 및 적용의 예에 대해서 정리해보고자 한다. 또한, 실제 다양한 질병에서 적용되고 있는 치료적인 활용법에 대해서 소개하고자 한다.
2. 주요 내용
2.1. CRISPR의 원리
CRISPR-Cas 시스템은 크게 Class 1 과 Class 2로 나뉘며, 하위단계에서 6가지의 종류로 추가로 나뉜다. Class 1에는 I, III, IV 타입이 해당되며 한 개 이상의 Cas 단백질을 사용하는 것으로 알려져 있다. Class 2는 II, V, VI 타입이 포함되고 오직 한 개의 Cas 단백질이 사용된다. Class I은 인식되는 전체 CRISPR-Cas 위치 중에서 약 90%를 편집할 수 있으며, 나머지 10%는 Class II에서 담당한다. 보통 함께 ribonucleoprotein 복합체를 이루고 있으며, crRNA 및 Cas 단백질을 포함하고 있다. Class II는 Cas9 단백질과 single guide RNA (sgRNA)를 통해 특정 부분만 편집할 수 있다. Type II는 최근까지 유전자 편집에 가장 잘 쓰이고 있는 시스템이다. 이 시스템에서는 Cas9 단백질을 이용하며, PAM sequence 또는 Protospacer Adjacent Motif 서열이 CRISPR RNA와 표적 서열 사이에서 상보적인 관계를 인식하여 유전자 편집이 가능하게 한다.
방어 기작으로 작용하는 CRISPR/Cas 시스템은 크게 3단계로 이루어진다. 첫 번째는 외부물질에 대한 적응단계로, protospacer라고도 불리는 특정 서열이 새로운 요소를 더 생산할 수 있도록 CRISPR array 내에서 조절된다. 이는 외부인자에 대한 유전정보를 기억하여 더 즉각적인 면역반응이 가능하도록 하는 단계이다. 그 다음으로는 CRISPR array가 전사인자에 의해서 pre-crRNA로 변환되는 단계로, 이는 성숙된 guide CRISPR RNA를 형성한다. 이 단계에서는 면역력이 증가하게 된다. 마지막으로는 표적물질을 방해하는 단계이다. crRNA를 통해 외부유전자의 공격을 저해하는 단계이다.
CRISPR/Cas9 시스템은 편집 위치를 알려주는 가이드 RNA와 가위 역할을 하는 효소인 Cas9이 함께 작동하는 원리로 작용한다 [2]. 첫 단계로, 표적 특이적인 sgRNA가 제작된다. sgRNA는 표적 특이적인 crRNA 및 tracrRNA로 이루어져 있다. 제작된 sgRNA는 Cas9 단백질과 함께 다양한 방법으로 표적 세포 내에 유입하게 된다. 그 후, 유입된 sgRNA와 Cas9 단백질은 직접적으로 바이러스의 DNA 서열에 결합한다. 결합하는 정도는 PAM sequence라 하는 특정 서열의 여부에 따라 결정된다. 즉, CRISPR/Cas9이 작동하기 위해서는 표적유전자의 서열에 PAM sequence가 존재하고 있어야 한다. 표적 유전자에 붙은 후 Cas9은 유전자를 절단하는 과정을 거친다. 절단된 DNA는 복구과정을 거치게 되는데, 절단 시에 종결 codon을 삽입하거나, frame shift를 유도하여 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있으며, 원하는 서열을 도입하여 knock-in gene editing도 가능하다.
CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 다양한 유전자의 발현을 저해하거나, 유전정보의 편집을 이용하여 다양한 질병에서 치료적인 적용이 가능하며, 현재 이를 이용한 치료책의 개발동향에 대해 함께 살펴보고자 한다.
2.2. 치료책으로서의CRISPR의 활용
2.2.1. 혈액질환 (Genetic blood disease)
겸상 적혈구 빈혈증 – 겸상 적혈구 빈혈증 (Sickle cell disease; SCD)은 유전적으로 상속되는 열성유전병으로 11번째 염색체의 오직 한 부분이 대체되어 나타나는 질병이다. 이로 인해서 glutamic acid가 valine으로 치환되어 헤모글로빈 S의 구조에 변형을 가져오게 되며 이는 질병을 야기하는 것으로 알려져 있다. 변형된 헤모글로빈 S는 끈적거리며 서로 잘 뭉치기 때문에 응집하여 쌓이게 된다. 뭉치지 않은 일부 적혈구는 현미경상에서 낫의 모양으로 관찰되며, 이들은 혈관 벽, 세포 벽에 늘어져 있는 형태로 쌓이게 된다. 이러한 현상이 겸상 적혈구 빈혈증을 야기하는 것으로 알려져 있다. 혈관을 막고, 혈류를 방해하여 순환에 문제가 생기게 된다. 현재 FDA에 승인을 받은 약품은 오직 2가지뿐이며 그 효과 또한 미미한 것으로 알려져 있다.
CRISPR/Cas9을 이용한 치료법은 2가지 접근 법이 연구 중이다. 첫 번째는 정상적인 헤모글로빈 S의 구조를 이룰 수 있게 유전자를 복구하는 방법과, 두 번째는 헤모글로빈 S를 헤모글로빈 F로 대체하는 방법이다. 이 두 방법은 모두 환자의 hematopoietic progenitor stem cell (줄기세포)를 조절하는 방법으로 이루어지며, 변형된 세포를 환자에 재 주입하는 방법을 이용한다 [3]. 헤모글로빈 F로 대체하는 방법은 β-globin gene을 변형하는 첫 번째 방법보다 더 치료적으로 적용하는 시점에 더 근접해 있다. BCL11A 유전자를 돌연변이화 하여 hemoglobin F의 발현을 간접적으로 촉진하는 방법이다. 이는 겸상 적혈구 빈혈증 환자에서 BCL11A 유전자가 돌연변이화 되어있는 경우 병증에 저항성을 보이는 현상에서 발견되었다. BCL11A의 발현을 억제함으로 인해서 헤모글로빈 F의 발현이 유의미하게 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 응용하여 CTX001이라는 drug이 실제로 겸상 적혈구 빈혈증에 치료적인 효과를 보이는 사실을 관찰하였다.
2.2.2. Cancer (암)
CRISPR를 이용한 암세포의 치료전략은 T 세포의 변형을 기반으로 한다. T 세포는 암세포를 죽일 수 있는 능력을 지닌 면역세포로 알려져 있다. T 세포 내에서 CRISPR를 이용하여 세 가지의 유전자를 제거하는 방법을 통해 암세포의 제거를 유도하는데, 두 유전자는 NY-ESO-1 수용체에 대한 유전자이고, 나머지 하나는 암세포를 죽이는 세포의 능력을 저해하는 유전자이다. 이렇게 변형된 세포는 NYCE T 세포라 하여 다량으로 증식되어 환자에 다시 투여되는 과정을 거친다. CRISPR/Cas9 은 암 연구분야에서 매우 빠른 속도로 발달할 수 있는 가능성을 보인다. 종양생성 기작을 매우 효율적으로 해부할 수 있으며, 이는 새로운 치료제 개발을 위한 표적을 찾는 데 도움이 될 수 있다 [4]. CRISPR pool을 이용한 스크리닝 연구는 암세포에서 필수적인 유전자를 찾아내기 위해 현재까지 여러 연구실에서 수행되고 있다. CRISPR를 이용한 기술이 동반된다면 치료제 개발과 표적물질의 발견이 더욱 가속화될 수 있다. CRISPR/Cas9 기술이 암 치료에 적용되는 방법은 다음과 같다.
2.2.3. Blindness
레버 선천성 흑암시 (Leber Congenital Amaurosis (LCA))는 매우 드문 유전성 질병으로, 태어날 때부터 혹은 소아기에 시력의 심각한 소실을 가져오는 것이 특징이다. 소아의 시력손상을 일으키는 이 증상을 완화시킬 수 있는 치료법은 현재 알려져 있는 것이 없다. CEP290 유전자의 돌연변이로 발생하는 LCA10은 심각한 시력손상을 보인다. CEP290 는 7.9kb 가량 되는 매우 큰 유전자인데, 이를 억제하기 위해서 EDIT-101이라는 잠재적 유전자가 고안되었다. 이는 CEP290의 splicing deficiency를 살아있는 조직 내에서 고칠 수 있게 개발된 방법이다. IVS26 돌연변이는 비정상적인 splicing donor를 야기하며 SaCas9에 의해서 제거하도록 설계되었다. 사람의 CEP290와 IVS26가 들어간 쥐 모델에서 아데노바이러스의 농도가 낮음에도 불구하고 94%의 쥐에서 눈이 치료되었다. 현재는 EDIT-101을 LCA10에 적용하기 위한 임상실험이 시작되었다. CORD6는 GUCY2D의 gain-of-function 돌연변이에 의해 발병한다. 아데노 바이러스를 이용하여 GUCY2D의 초기 염기서열을 저해하는 CRISPR/Cas 를 쥐에 주입하게 될 경우, 유전적인 시력 손상을 막는 것을 관찰하였다 [5]. 최근에는 dCas9-VPR을 이용하여 silent 유전자가 활성화되는 것을 관찰하였다. 이는 rhodopsin이 없는 쥐에 주입할 경우 부작용 없이 망막에서 photoreceptor-specific M-opsin의 발현이 증가되도록 할 수 있었다.
2.2.4. 헌팅턴병 (Huntington Disease)
헌팅턴병은 헌팅틴 유전자 (HTT gene)의 polyglutamine 반복서열에 의해서 발병한다고 알려져 있다. 반복서열이 포함된 HTT 유전자가 응집하여 aggregate을 이루게 되면 헌팅턴병이 발병한다. CRISPR의 편집도구를 이용하면 HTT 응집체를 성공적으로 저해할 수 있으며, 초기 신경세포의 감소를 막을 수 있다. 또한 CRISPR 시스템을 이용하면 뇌에서 신경세포의 독성에 의한 기작을 효율적으로 저해할 수도 있다. 헌팅턴병 외에 비슷한 접근법을 통해서 다른 퇴행성 뇌 질환에서도 긍정적인 치료결과를 관찰하였다. CRISPR/Cas9을 이용하여 HTT 유전자의 발현을 저해하는 것은 헌팅턴병의 치료법 중 하나로 알려져 있다. 그러나 이를 실제 치료에 적용하기 위해서는 더 많은 연구가 필요한 상황이다. 쥐에서는 CRISPR/Cas9에 의해 mHTT의 발현을 감소시키는데 성공하였다. 또한, TRPC1 유전자를 저해함으로써 운동능력이 유의미하게 증가하는 것도 관찰할 수 있었다 [6].
2.2.5. 미토콘드리아서 뇌근육병증 (Mitochondrial disorder)
미토콘드리아성 뇌근육병증은 사립체 유전자(미토콘드리아 DNA, mtDNA)의 돌연변이에 의해 발생하는 유전 질환이다. 현재까지 이 질병의 치료법은 개발되어 있지 않은 상황이다. 그러나 다양한 유전적 접근법들이 현재 연구가 진행 중에 있다. 예를 들어 MioTALENs, mito-ZNF 등이 있으며, 이들은 mtDNA를 조절하는 방법으로 mtDNA 내 특정 서열을 절단하는 원리로 작용한다.
최근에는 CRISPR/Cas9 시스템이 mtDNA를 돌연변이화하는 데 이용되고 있다. mtDNA를 표적으로 하여 mtDNA의 수를 줄이는 데 적용된다 [7]. Inter-bacterial cytidine deaminase toxin (DddA)는 미토콘드리아의 CRISPR-free-base-editing 이 가능한 방법이다. Base-editing은 RNA로부터 자유롭기 때문에 mtDNA내 특정 부분을 대체하는 효율이 증가한다. 발달된 Base-editing 기술은 아마 mtDNA 내 유해한 돌연변이를 고치는데 사용될 수 있다. 효율적인 시술이 개발될 수 있음에도 불구하고 미토콘드리아 내에서의 편집이 이루어져야 하기 때문에 아직은 많은 한계점이 존재한다. 우선, Cas9은 큰 단백질이기 때문에 미토콘드리아로 잘 들어가는지가 관건이 될 것이다. 또한 gRNA는 특징적인 stem-loop 구조를 이루고 있어야 하는데, 이것이 미토콘드리아로 잘 전달되는지도 중요한 요소이다. 이는 현재까지는 미토콘드리아 내에 효율적으로 이동이 되지 않고 있기 때문에 더 많은 연구가 필요한 상황이다.
2.2.6. COVID-19
COVID-19의 감염을 치료하기 위한 전략으로 CRISPR 역시 현재 연구 중에 있다. CRISPR-Cas13은 박테리아 세포를 감염으로부터 보호할 수 있다고 알려져 있다. 이를 SARS-CoV-2에 적용할 수 있다. Nguyen 연구팀에서는 이 기술을 이용하여 ORF1ab를 표적으로 하여 CRISPR/Cas13d가 작용하도록 고안하였다. 또 다른 표적으로는 RdRp 유전자도 알려져 있다. Cas13d는 COVID-19에 사용될 수 있도록 이상적이고 독특한 특징을 가지고 있다. 이들의 활성은 PAM-like 서열에 비례한다. Cas13d 단백질은 아데노 바이러스를 통해서 환자에게 전달이 가능하다고 알려져 있다. 또한, AAV의 serotype에 따라 폐 조직으로 특이적으로 이동도 가능하다. 최근에는 CRISPR-Cas-13을 기반으로 한 COVID-19 감염 치료 연구가 발표되었다 [8]. 이 치료법은 PAC-MAN이라고 불린다. 이 보고에 따르면 폐 조직 내 세포에서 COVID-19나 인플루엔자 바이러스의 유전서열을 변형시킨 것으로 보고되고 있다. 이러한 치료 접근법은 아직은 더 많은 연구가 필요하지만, 현재와 같은 팬데믹 상황에서는 치료개발을 위한 좋은 연구가 될 수 있다.
3. 결론
유전질환은 가족력에 따라 발병하기 때문에 발병 전에 미리 예측이 가능하며, 치료법만 있다면 발병을 막을 수 있는 가능성도 높아진다. 그러나, 유전자의 변형에 의한 질병이기 때문에 궁극적인 치료가 어려운 단점도 존재한다. CRISPR를 이용한 유전자 편집 기술은 이러한 유전병의 한계를 해결해줄 수 있는 좋은 도구이다. 문제가 되는 조직에서의 세포 내 유전자만 조절한다면 충분히 질병 치료가 가능하기 때문이다. 또한, 한 질병에 국한되지 않고 다양한 세포에서 적용이 가능하기 때문에 병의 종류를 가리지 않고 널리 이용될 수 있는 효율성이 높은 기술이기도 하다. 본 리포트에서는 일부 유전병에 대한 것만 소개하였지만, 실제로는 더 많은 질병에서 CRISPR를 이용한 치료책이 연구 중에 있다. CRISPR를 이용한 연구는 단순히 세포생물학 단계에서 연구를 더 빠르고 편리하게 수행할 수 있게 해줄 뿐만 아니라 직접적으로 치료에 이용될 수 있기 때문에 매우 매력적인 방법이며, 이를 잘 응용하고 발달시킨다면 더 무한한 가능성을 가지고 있다고 생각한다.
세상에 존재하는 다양한 질병들 중에서 상당수가 유전적인 원인으로 발병하는 것으로 잘 알려져 있다. 유전적으로 발병하는 질병들은 특정 유전자에 변이 혹은 소실로 인해서 세포 내 특정 단백질이 제 기능을 못하거나 이상 기능을 발현함으로 인해서 발생한다. 유전적인 원인으로 발병하는 질병은 전세계적으로 태어나는 신생아를 기준으로 하였을 때 2-5%를 차지하며 그 중에서 50%는 오래 살지 못하고 죽는 것으로 알려져 있다.
유전자 편집 및 유전자 치료는 최근 몇 년 동안 연구분야에서 매우 각광받고 있는 기술이다. 유전자의 특정 부분을 변형하여 유전자 정보를 편집하고 이를 통해 질병을 치료하는 방법은 질병의 종류에 관계없이 유전자 변형에 의한 질병이라면 어디에든 적용가능하기 때문에 매우 효율성이 높은 기술이다. 유전자를 편집하는 방법들 중에서 CRISPR/Cas system은 질병 치료에 적용될 수 있을 정도로 매우 효율적이고 간편하다. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)은 E.coli에서 최초로 발견되었으며, 이후 다양한 박테리아에서도 보고되기 시작하였다. CRISPR/Cas system은 외부에서 들어온 DNA를 인지하고 죽이기 위한 원핵생물에서의 면역반응이다 [1]. CRISPR와 함께 관련 단백질로 Cas 단백질이 발견되었으며, 이는 후천면역과 관련된 단백질로 알려져 있다. 이 기술은 DNA와 RNA 모두에서 적용이 가능하다. Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) 및 zinc-finger nucleases (ZFNs)와 같은 다른 유전자 편집 기술보다 더 정확하고 쉬우며 연구에서도 빠르게 발전하고 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 외부로부터 들어온 DNA/RNA 내 특정 서열을 인지하고 절단한다. 이를 이용한 방법은 원하는 부분을 직접 잘라내고 삽입할 수 있으며, 이를 통해서 유전정보를 편집하여 질병을 유발하는 유전자나 특정 기능을 향상시킬 수 있다. 최근까지의 개발 동향을 살펴보면, 이러한 편집 기술들은 실제로 치료방법으로서의 무궁한 가능성을 가지고 있으며, 실제로 적용이 가능하지 연구가 다양한 질병연구에서 진행 중에 있다. 따라서 본 리포트에서는 CRISPR/Cas 유전자 편집 기술의 원리 및 적용의 예에 대해서 정리해보고자 한다. 또한, 실제 다양한 질병에서 적용되고 있는 치료적인 활용법에 대해서 소개하고자 한다.
2. 주요 내용
2.1. CRISPR의 원리
CRISPR-Cas 시스템은 크게 Class 1 과 Class 2로 나뉘며, 하위단계에서 6가지의 종류로 추가로 나뉜다. Class 1에는 I, III, IV 타입이 해당되며 한 개 이상의 Cas 단백질을 사용하는 것으로 알려져 있다. Class 2는 II, V, VI 타입이 포함되고 오직 한 개의 Cas 단백질이 사용된다. Class I은 인식되는 전체 CRISPR-Cas 위치 중에서 약 90%를 편집할 수 있으며, 나머지 10%는 Class II에서 담당한다. 보통 함께 ribonucleoprotein 복합체를 이루고 있으며, crRNA 및 Cas 단백질을 포함하고 있다. Class II는 Cas9 단백질과 single guide RNA (sgRNA)를 통해 특정 부분만 편집할 수 있다. Type II는 최근까지 유전자 편집에 가장 잘 쓰이고 있는 시스템이다. 이 시스템에서는 Cas9 단백질을 이용하며, PAM sequence 또는 Protospacer Adjacent Motif 서열이 CRISPR RNA와 표적 서열 사이에서 상보적인 관계를 인식하여 유전자 편집이 가능하게 한다.
방어 기작으로 작용하는 CRISPR/Cas 시스템은 크게 3단계로 이루어진다. 첫 번째는 외부물질에 대한 적응단계로, protospacer라고도 불리는 특정 서열이 새로운 요소를 더 생산할 수 있도록 CRISPR array 내에서 조절된다. 이는 외부인자에 대한 유전정보를 기억하여 더 즉각적인 면역반응이 가능하도록 하는 단계이다. 그 다음으로는 CRISPR array가 전사인자에 의해서 pre-crRNA로 변환되는 단계로, 이는 성숙된 guide CRISPR RNA를 형성한다. 이 단계에서는 면역력이 증가하게 된다. 마지막으로는 표적물질을 방해하는 단계이다. crRNA를 통해 외부유전자의 공격을 저해하는 단계이다.
CRISPR/Cas9 시스템은 편집 위치를 알려주는 가이드 RNA와 가위 역할을 하는 효소인 Cas9이 함께 작동하는 원리로 작용한다 [2]. 첫 단계로, 표적 특이적인 sgRNA가 제작된다. sgRNA는 표적 특이적인 crRNA 및 tracrRNA로 이루어져 있다. 제작된 sgRNA는 Cas9 단백질과 함께 다양한 방법으로 표적 세포 내에 유입하게 된다. 그 후, 유입된 sgRNA와 Cas9 단백질은 직접적으로 바이러스의 DNA 서열에 결합한다. 결합하는 정도는 PAM sequence라 하는 특정 서열의 여부에 따라 결정된다. 즉, CRISPR/Cas9이 작동하기 위해서는 표적유전자의 서열에 PAM sequence가 존재하고 있어야 한다. 표적 유전자에 붙은 후 Cas9은 유전자를 절단하는 과정을 거친다. 절단된 DNA는 복구과정을 거치게 되는데, 절단 시에 종결 codon을 삽입하거나, frame shift를 유도하여 표적 유전자의 발현을 저해할 수 있으며, 원하는 서열을 도입하여 knock-in gene editing도 가능하다.
CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 다양한 유전자의 발현을 저해하거나, 유전정보의 편집을 이용하여 다양한 질병에서 치료적인 적용이 가능하며, 현재 이를 이용한 치료책의 개발동향에 대해 함께 살펴보고자 한다.
2.2. 치료책으로서의CRISPR의 활용
2.2.1. 혈액질환 (Genetic blood disease)
겸상 적혈구 빈혈증 – 겸상 적혈구 빈혈증 (Sickle cell disease; SCD)은 유전적으로 상속되는 열성유전병으로 11번째 염색체의 오직 한 부분이 대체되어 나타나는 질병이다. 이로 인해서 glutamic acid가 valine으로 치환되어 헤모글로빈 S의 구조에 변형을 가져오게 되며 이는 질병을 야기하는 것으로 알려져 있다. 변형된 헤모글로빈 S는 끈적거리며 서로 잘 뭉치기 때문에 응집하여 쌓이게 된다. 뭉치지 않은 일부 적혈구는 현미경상에서 낫의 모양으로 관찰되며, 이들은 혈관 벽, 세포 벽에 늘어져 있는 형태로 쌓이게 된다. 이러한 현상이 겸상 적혈구 빈혈증을 야기하는 것으로 알려져 있다. 혈관을 막고, 혈류를 방해하여 순환에 문제가 생기게 된다. 현재 FDA에 승인을 받은 약품은 오직 2가지뿐이며 그 효과 또한 미미한 것으로 알려져 있다.
CRISPR/Cas9을 이용한 치료법은 2가지 접근 법이 연구 중이다. 첫 번째는 정상적인 헤모글로빈 S의 구조를 이룰 수 있게 유전자를 복구하는 방법과, 두 번째는 헤모글로빈 S를 헤모글로빈 F로 대체하는 방법이다. 이 두 방법은 모두 환자의 hematopoietic progenitor stem cell (줄기세포)를 조절하는 방법으로 이루어지며, 변형된 세포를 환자에 재 주입하는 방법을 이용한다 [3]. 헤모글로빈 F로 대체하는 방법은 β-globin gene을 변형하는 첫 번째 방법보다 더 치료적으로 적용하는 시점에 더 근접해 있다. BCL11A 유전자를 돌연변이화 하여 hemoglobin F의 발현을 간접적으로 촉진하는 방법이다. 이는 겸상 적혈구 빈혈증 환자에서 BCL11A 유전자가 돌연변이화 되어있는 경우 병증에 저항성을 보이는 현상에서 발견되었다. BCL11A의 발현을 억제함으로 인해서 헤모글로빈 F의 발현이 유의미하게 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 응용하여 CTX001이라는 drug이 실제로 겸상 적혈구 빈혈증에 치료적인 효과를 보이는 사실을 관찰하였다.
2.2.2. Cancer (암)
CRISPR를 이용한 암세포의 치료전략은 T 세포의 변형을 기반으로 한다. T 세포는 암세포를 죽일 수 있는 능력을 지닌 면역세포로 알려져 있다. T 세포 내에서 CRISPR를 이용하여 세 가지의 유전자를 제거하는 방법을 통해 암세포의 제거를 유도하는데, 두 유전자는 NY-ESO-1 수용체에 대한 유전자이고, 나머지 하나는 암세포를 죽이는 세포의 능력을 저해하는 유전자이다. 이렇게 변형된 세포는 NYCE T 세포라 하여 다량으로 증식되어 환자에 다시 투여되는 과정을 거친다. CRISPR/Cas9 은 암 연구분야에서 매우 빠른 속도로 발달할 수 있는 가능성을 보인다. 종양생성 기작을 매우 효율적으로 해부할 수 있으며, 이는 새로운 치료제 개발을 위한 표적을 찾는 데 도움이 될 수 있다 [4]. CRISPR pool을 이용한 스크리닝 연구는 암세포에서 필수적인 유전자를 찾아내기 위해 현재까지 여러 연구실에서 수행되고 있다. CRISPR를 이용한 기술이 동반된다면 치료제 개발과 표적물질의 발견이 더욱 가속화될 수 있다. CRISPR/Cas9 기술이 암 치료에 적용되는 방법은 다음과 같다.
- Cell transformation – 이 방법은 환자로부터 암세포를 채취하여 배양한 후, 세포를 CRISPR를 이용하여 적절히 변형시킨 후 다시 순환계로 주입하는 방법이다. 배양된 세포는 세포의 death receptor 유전자를 knock-out 시킨 후, cancer-killing drug에 반응하는 유전자가 암세포에 전달된다. 이렇게 변형된 암세포는 다시 조직의 순환계로 주입된다. 변형된 세포는 전이된 종양을 찾아서 자가소멸을 통해 공격할 수 있다.
- 모델 연구 – CRISPR를 이용하여 암세포나 유사한 질병을 조직에 야기하여 암세포의 모델 연구에 이용될 수 있다.
- 면역치료 – CRISPR 스크니링을 통해서 새로운 시약 표적으로 Ptpn2가 발견되었다. 이는 암세포의 면역치료에 관여하는 기작으로, CRISPR가 암세포의 면역치료 개발에 이용된 예라고 볼 수 있다.
- 다른 치료와의 융합 – CRISPR는 cAR-T와 같은 다른 치료책과 융합되어 이용될 수 있다. CRISPR를 이용하여 CAR-T 세포나 AR-T세포의 효율을 증가시켜 암세포와 싸울 수 있는 가능성을 높일 수 있기 때문이다.
- 암세포의 돌연변이화 – 특정 암세포의 돌연변이를 통해 암세포의 유전자를 돌연변이화하거나 무력화시킬 수 있다.
2.2.3. Blindness
레버 선천성 흑암시 (Leber Congenital Amaurosis (LCA))는 매우 드문 유전성 질병으로, 태어날 때부터 혹은 소아기에 시력의 심각한 소실을 가져오는 것이 특징이다. 소아의 시력손상을 일으키는 이 증상을 완화시킬 수 있는 치료법은 현재 알려져 있는 것이 없다. CEP290 유전자의 돌연변이로 발생하는 LCA10은 심각한 시력손상을 보인다. CEP290 는 7.9kb 가량 되는 매우 큰 유전자인데, 이를 억제하기 위해서 EDIT-101이라는 잠재적 유전자가 고안되었다. 이는 CEP290의 splicing deficiency를 살아있는 조직 내에서 고칠 수 있게 개발된 방법이다. IVS26 돌연변이는 비정상적인 splicing donor를 야기하며 SaCas9에 의해서 제거하도록 설계되었다. 사람의 CEP290와 IVS26가 들어간 쥐 모델에서 아데노바이러스의 농도가 낮음에도 불구하고 94%의 쥐에서 눈이 치료되었다. 현재는 EDIT-101을 LCA10에 적용하기 위한 임상실험이 시작되었다. CORD6는 GUCY2D의 gain-of-function 돌연변이에 의해 발병한다. 아데노 바이러스를 이용하여 GUCY2D의 초기 염기서열을 저해하는 CRISPR/Cas 를 쥐에 주입하게 될 경우, 유전적인 시력 손상을 막는 것을 관찰하였다 [5]. 최근에는 dCas9-VPR을 이용하여 silent 유전자가 활성화되는 것을 관찰하였다. 이는 rhodopsin이 없는 쥐에 주입할 경우 부작용 없이 망막에서 photoreceptor-specific M-opsin의 발현이 증가되도록 할 수 있었다.
2.2.4. 헌팅턴병 (Huntington Disease)
헌팅턴병은 헌팅틴 유전자 (HTT gene)의 polyglutamine 반복서열에 의해서 발병한다고 알려져 있다. 반복서열이 포함된 HTT 유전자가 응집하여 aggregate을 이루게 되면 헌팅턴병이 발병한다. CRISPR의 편집도구를 이용하면 HTT 응집체를 성공적으로 저해할 수 있으며, 초기 신경세포의 감소를 막을 수 있다. 또한 CRISPR 시스템을 이용하면 뇌에서 신경세포의 독성에 의한 기작을 효율적으로 저해할 수도 있다. 헌팅턴병 외에 비슷한 접근법을 통해서 다른 퇴행성 뇌 질환에서도 긍정적인 치료결과를 관찰하였다. CRISPR/Cas9을 이용하여 HTT 유전자의 발현을 저해하는 것은 헌팅턴병의 치료법 중 하나로 알려져 있다. 그러나 이를 실제 치료에 적용하기 위해서는 더 많은 연구가 필요한 상황이다. 쥐에서는 CRISPR/Cas9에 의해 mHTT의 발현을 감소시키는데 성공하였다. 또한, TRPC1 유전자를 저해함으로써 운동능력이 유의미하게 증가하는 것도 관찰할 수 있었다 [6].
2.2.5. 미토콘드리아서 뇌근육병증 (Mitochondrial disorder)
미토콘드리아성 뇌근육병증은 사립체 유전자(미토콘드리아 DNA, mtDNA)의 돌연변이에 의해 발생하는 유전 질환이다. 현재까지 이 질병의 치료법은 개발되어 있지 않은 상황이다. 그러나 다양한 유전적 접근법들이 현재 연구가 진행 중에 있다. 예를 들어 MioTALENs, mito-ZNF 등이 있으며, 이들은 mtDNA를 조절하는 방법으로 mtDNA 내 특정 서열을 절단하는 원리로 작용한다.
최근에는 CRISPR/Cas9 시스템이 mtDNA를 돌연변이화하는 데 이용되고 있다. mtDNA를 표적으로 하여 mtDNA의 수를 줄이는 데 적용된다 [7]. Inter-bacterial cytidine deaminase toxin (DddA)는 미토콘드리아의 CRISPR-free-base-editing 이 가능한 방법이다. Base-editing은 RNA로부터 자유롭기 때문에 mtDNA내 특정 부분을 대체하는 효율이 증가한다. 발달된 Base-editing 기술은 아마 mtDNA 내 유해한 돌연변이를 고치는데 사용될 수 있다. 효율적인 시술이 개발될 수 있음에도 불구하고 미토콘드리아 내에서의 편집이 이루어져야 하기 때문에 아직은 많은 한계점이 존재한다. 우선, Cas9은 큰 단백질이기 때문에 미토콘드리아로 잘 들어가는지가 관건이 될 것이다. 또한 gRNA는 특징적인 stem-loop 구조를 이루고 있어야 하는데, 이것이 미토콘드리아로 잘 전달되는지도 중요한 요소이다. 이는 현재까지는 미토콘드리아 내에 효율적으로 이동이 되지 않고 있기 때문에 더 많은 연구가 필요한 상황이다.
2.2.6. COVID-19
COVID-19의 감염을 치료하기 위한 전략으로 CRISPR 역시 현재 연구 중에 있다. CRISPR-Cas13은 박테리아 세포를 감염으로부터 보호할 수 있다고 알려져 있다. 이를 SARS-CoV-2에 적용할 수 있다. Nguyen 연구팀에서는 이 기술을 이용하여 ORF1ab를 표적으로 하여 CRISPR/Cas13d가 작용하도록 고안하였다. 또 다른 표적으로는 RdRp 유전자도 알려져 있다. Cas13d는 COVID-19에 사용될 수 있도록 이상적이고 독특한 특징을 가지고 있다. 이들의 활성은 PAM-like 서열에 비례한다. Cas13d 단백질은 아데노 바이러스를 통해서 환자에게 전달이 가능하다고 알려져 있다. 또한, AAV의 serotype에 따라 폐 조직으로 특이적으로 이동도 가능하다. 최근에는 CRISPR-Cas-13을 기반으로 한 COVID-19 감염 치료 연구가 발표되었다 [8]. 이 치료법은 PAC-MAN이라고 불린다. 이 보고에 따르면 폐 조직 내 세포에서 COVID-19나 인플루엔자 바이러스의 유전서열을 변형시킨 것으로 보고되고 있다. 이러한 치료 접근법은 아직은 더 많은 연구가 필요하지만, 현재와 같은 팬데믹 상황에서는 치료개발을 위한 좋은 연구가 될 수 있다.
3. 결론
유전질환은 가족력에 따라 발병하기 때문에 발병 전에 미리 예측이 가능하며, 치료법만 있다면 발병을 막을 수 있는 가능성도 높아진다. 그러나, 유전자의 변형에 의한 질병이기 때문에 궁극적인 치료가 어려운 단점도 존재한다. CRISPR를 이용한 유전자 편집 기술은 이러한 유전병의 한계를 해결해줄 수 있는 좋은 도구이다. 문제가 되는 조직에서의 세포 내 유전자만 조절한다면 충분히 질병 치료가 가능하기 때문이다. 또한, 한 질병에 국한되지 않고 다양한 세포에서 적용이 가능하기 때문에 병의 종류를 가리지 않고 널리 이용될 수 있는 효율성이 높은 기술이기도 하다. 본 리포트에서는 일부 유전병에 대한 것만 소개하였지만, 실제로는 더 많은 질병에서 CRISPR를 이용한 치료책이 연구 중에 있다. CRISPR를 이용한 연구는 단순히 세포생물학 단계에서 연구를 더 빠르고 편리하게 수행할 수 있게 해줄 뿐만 아니라 직접적으로 치료에 이용될 수 있기 때문에 매우 매력적인 방법이며, 이를 잘 응용하고 발달시킨다면 더 무한한 가능성을 가지고 있다고 생각한다.