Postsynaptic density protein과 자폐증과 관련된 모델 쥐의 활용
2021-09-15
org.kosen.entty.User@5a70aaae
정선민(sakura8528)
1. 개요
정신장애 (psychiatric disorder)는 정신 질환, 정신 이상이라고도 하며, 개체의 생각, 행동, 인지능력에 영향을 준다. 정신장애에는 우울증, 양극성 장애, 정신 분열증 및 자폐증 등 다양한 종류의 질환이 포함된다. 이들 질환은 모두 의학적으로 다른 증세를 보이며 증세에 따라 서로 구별될 수 있다. 정신장애는 비정상적인 행동, 생각, 인지능력, 감정, 그리고 타인과의 사회적 교감의 조합에 의해 구별된다. 정신장애는 생물학적, 심리적, 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 발생한다. 정신 장애의 병인을 설명하기 위해 인간 환자를 대상으로 한 여러 유전 연구에서 정신 장애의 발병과 관련된 잠재적 유전자를 확인할 수 있다. 최근까지 수행된 대규모 게놈 연구는 여러 개의 시냅스 후 유전자 세트에서 인간 정신 장애의 돌연변이를 발견하였는데, 이러한 발견을 통해 정신 장애와 관련된 유전적 돌연변이를 가진 모델 마우스를 생성할 수 있다. 정신 장애의 행동 특성을 탐구하는 유전적 마우스 모델은 근본적인 분자 메커니즘을 이해하고 장애의 치료 전략을 개발하는 데 유용한 도구이다. 예를 들어, Shank3 유전자는 자폐증이 있는 인간 환자의 유전자 연구를 통해 확인되었으며[1], Shank3 단백질은 실제로 마우스 모델을 통해 자폐증 (ASD)과 관련이 있다고 밝혀졌다.
시냅스 후 밀도 (postsynaptic density [PSD])는 흥분성 시냅스 (excitatory synapses)의 dendritic spines 내에 위치하는 거대한 복합체다. PSD는 scaffolding 단백질, 세포 접착 분자 (cell adhesion molecules), 신경전달물질 수용체 (neurotransmitter receptors), 막 수송 단백질 (membrane trafficking proteins) 및 세포골격 단백질 (cytoskeleton proteins)을 비롯한 수천 개의 단백질로 구성되어 있다[2]. PSD 단백질로 구성된 거대한 막 관련 단백질 복합체는 dendritic spines 형성, 시냅스 후 신호 전달 및 시냅스 가소성에 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다.
시냅스 후 scaffolding 단백질은 시냅스 신호 전달과 관련된 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 제공하는 PSD 단백질 복합체의 주요 구성요소이다. 많은 유전자 연구에서 시냅스 후 scaffolding 단백질의 돌연변이가 인간의 신경 및 정신 질환과 관련이 있음이 밝혀졌다. 시냅스 후 scaffolding 단백질을 제공하는 유전자의 돌연변이는 인간 정신 장애의 증상과 같은 비정상적인 사회적 행동 및 반복적인 일상을 포함한 행동 이상을 초래한다. 본 리포트에서 우리는 신경 발달 장애, 특히 자폐 스펙트럼 장애 (ASD)과 관련된 시냅스 후 scaffolding 단백질의 최근까지 연구된 돌연변이 쥐에 대해 정리하고자 한다. 모델 쥐의 행동 표현형과 이 단백질의 발병과 관련된 분자 기능에 대해서 함께 논의할 것이다.
2. 주요 내용
2.1. Postsynaptic density의 구조 및 scaffolding 단백질
신경계에서 시냅스는 화학적 신경전달물질의 방출과 작용을 통해 시냅스 전에서 시냅스 후 뉴런으로 전기 신호를 전달하는 데 필수적인 구조이다. 포유류의 뇌에서 대부분의 흥분성 시냅스(excitatory synapses)는 수상돌기를 따라 돌출된 부분에 위치하며, 이를 수상돌기(dendritic spines)라고 한다. 시냅스 후 밀도(PSD)는 흥분성 시냅스의 dendritic spines 내에 위치한 조밀한 영역으로, 디스크형 구조 단백질 복합체로 구성된다. PSD에 대한 단백질체 연구에 따르면 PSD에는 신경전달물질 수용체, 이온 채널, 신호전달 분자, 세포 부착 분자 및 scaffolding 단백질을 비롯한 수천 개의 별개의 단백질이 포함되어 있음이 밝혀졌다. PSD의 막 쪽에는 신경 전달 물질 수용체와 시냅스 간 접착 단백질이 포함되어 있다. 두 개의 글루타메이트 수용체, N-메틸-D-아스파르트산 수용체(NMDAR) 및 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속스-아졸프로피온산 수용체(AMPAR)는 PSD에 다량으로 분포하고 있다.
Postsynaptic scaffolding protein은 PSD에서 가장 많은 비중을 차지하는 단백질이다. Postsynaptic scaffolding 단백질은 PSD 단백질 간의 상호작용을 제공할 수 있는 거대한 동적 복합체를 형성하기 때문에, 시냅스 신호의 하위 전달 시 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다. Postsynaptic scaffolding 단백질은 PSD95 family, SH3 및 multiple Ankyrin repeat domain (Shank) family, A-kinase anchoring protein (AKAP) family, the Homer family, 그리고 the SAP90/PSD95-associated protein (SAPAP) family 가 포함된다. Postsynaptic scaffolding protein은 단백질간 상호작용을 위해 잘 보존된 도메인을 가지고 있다. 따라서, Postsynaptic scaffolding protein의 결합 도메인을 통한 동적 복합체 및 특정 단백질-단백질 상호작용은 시냅스 신호 전달에 중요하다고 알려져 있다.
2.2. Postsynaptic scaffolding protein 과 자폐증과의 관계
CDC의 자폐증 및 발달 장애 모니터링(ADDM) 네트워크의 추정에 따르면, 자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 미국 내 어린이 54명 중 1명에게 영향을 미치는 가장 널리 퍼진 신경 발달 장애다. ASD는 사회적 상호 작용 장애, 의사 소통 결함 및 반복 행동과 같은 임상적인 특징을 가진다. 자폐증의 진단은 아직까지 대부분이 행동으로만 정의되기 때문에 유전자 바이오마커를 이용하여 질병을 진단하기 위한 계속적인 노력이 있었다. 대량의 유전자 연구를 통해 ASD에 관여하는 다양한 후보 유전자가 확인되었는데, 그 중에서 잘 알려진 유전자는 시냅스 전 원형질막 단백질 (NRXN1-3), 시냅스 후 세포 접착 단백질 (NLGN1-3), 시냅스 후 scaffolding 단백질 (Shank1-3)이 있다. 이 단락에서는 ASD와 관련된 시냅스 후 scaffolding 단백질 돌연변이 쥐에 초점을 맞추어 알아보고자 한다. ASD의 행동 특성을 뒷받침하는 행동 표현형과 분자 메커니즘에 대해서 정리하였다.
2.2.1. SHANK mutant mice 의 행동적 특징
ProSAP로도 알려진 Shank 단백질은 글루탐산성 시냅스의 PSD에 위치한 거대한 scaffolding 단백질로, 시냅스 발달 및 기능에 필수적이라고 알려져 있다. Shank 단백질은 Shank1, Shank2 및 Shank3 유전자가 존재한다. 그 중 Shank3는 Phelan McDermid 증후군(PMS) 환자의 신경정신병적 증상과 관련하여 잘 알려진 유전자이다. 그 이후로 Shank3 de novo 돌연변이가 ASD 환자에서 처음 발견되었고, 다른 ASD 환자에서도 새로운 Shank3 돌연변이가 확인되었다. 현재까지 이루어진 연구들에서 3가지 Shank 유전자 모두의 돌연변이 또는 결실이 신경 발달 장애와 관련이 있음이 밝혀졌다. Shank1 유전자를 파괴하는 결실은 ASD 환자의 0.04%에서 발견되었으며, ASD에 특정한 de novo nonsense Shank2 돌연변이도 발견되었다.
Shank3 단백질은 뇌 영역, 발달 단계 및 세포 유형에 따라 다르게 발현되는 6개의 isoform을 가지고 있다[3]. 초기 연구에서 모든 Shank3 isoform을 제거하는 마우스를 만드는 데 실패하는 대신 Shank3 isoform이 없는 여러 Shank3 KO 마우스 라인이 특정 엑손의 돌연변이를 통해 생성되었다. 2010년부터 현재까지 Shank3 돌연변이 마우스는 고도로 보존된 PSD-95-Discs Large-zona occludens-1(PDZ) 도메인(Shank3E13-16), Ankyrin repeats 도메인(ANK)이 포함되는 엑손 4-9, 엑손 4-7, 엑손 9을 삭제하여 만들어졌다. 또한, SRC 상동성 3 도메인(SH3)(엑손 11) 및 Proline-rich domain (엑손21)이 결여된 마우스도 생성되었다. Shank3E13 마우스는 최근 엑손 12(E12)와 엑손 13(E13) 사이에 네오스톱 카세트를 삽입하여 생성되었다. 마지막으로 Shank3가 완전히 결여된 Knock-out 마우스 (엑손 4-22; Δe4–22-/-)가 최근에 보고되었다. 동일한 엑손 위치의 돌연변이에 대한 행동 테스트 결과는 세부적으로 보자면 다양하지만, 종합해보면 Shank3 KO 마우스는 일반적으로 반복적인 자기 손질 행동 (self-grooming), 사회적 상호 작용 장애 및 불안 유사 행동을 보인다. Shank3E13-16, Shank3E11 및 Δe4–22-/-(완전한 KO) 마우스는 자해적인 그루밍 행동을 나타냈다. 반면 마우스 Shank3E4-97 및 Shank3E 는 그루밍에서는 큰 변화가 없었다. Shank3 돌연변이 마우스는 Shank3E9와 Shank3E21을 제외하고는 대부분의 쥐가 사회적 능력과 상호작용이 손상되었다. 수컷이 암컷보다 ASD와 유사한 행동을 더 뚜렷하게 나타냄으로써, 사회적 상호작용에서 성별에 따른 차이를 보였다. Shank3의 엑손 4-9 및 Δe4-22-/- 마우스에서는 일반 쥐와는 구별되는 USV 패턴이 발견되었다. 형태학적으로 Shank3E4-9 및 Shank3E13-16 마우스에서 dendritic spine의 밀도가 감소하였으며, 길이도 짧아졌다. 이는 신경세포의 발달이 지연된다는 것을 보여준다. Shank3 돌연변이 마우스는 학습과 기억에서 다른 특징을 보였다. 예를 들어, Shank3E4-9, Shank3E11, Shank3E21 및 Δe4–22-/- 마우스는 MWM(Morris Water Maze test)를 수행하였을 때, 공간 학습에 대한 결함을 보였다. 이러한 서로 다른 특징은 Shank3의 subtype이 뇌에서 서로 다른 기능을 갖는다는 가설을 뒷받침하기도 한다.
두 종류의 Shank2 돌연변이 마우스가 각각 별개의 실험실에서 생성되었다. Shank2 유전자에서 exon 6-7 또는 exon 7의 유전적 결실은 모든 Shank2 isoforms의 완전한 결실을 초래하였다. 두 마우스 라인 모두 Shank2 isoform이 완전히 삭제된 모델이지만 ASD 관련 표현형에 대한 결과는 차이가 있었다. 엑손 7이 결여된 Shank2 KO 마우스 및 엑손 6-7이 결여된 Shank2 KO 마우스는 반복적인 행동을 보였다. 감소된 USV는 Shank2 KO 마우스 모두에서 발견되었다. 엑손 7이 결핍된 성체 Shank2 KO 마우스는 USV에서 음향 이상이 나타났으며 소리의 피크와 주파수가 모두 감소하였다. 엑손 6-7이 결여된 성체 Shank2 KO 마우스에서는 암수 상호작용 시 소리를 더 적게 내는 사실을 발견하였다. 감소된 dendritic spine의 밀도와 더 작은 PSD는 엑손 7이 삭제된 마우스에서만 발견되었다. 최근 보고된 연구에서는 해마와 striatum에서 시냅스 및 행동 표현형의 뚜렷한 변화가 관찰되었다. 흥분성 뉴런 특이적인 Shank2 녹아웃 수컷 마우스(CaMKII-Cre)는 명암 테스트에서 사회적 상호 작용이 감소하였으며, 사회적 의사소통이 경미하게 감소하고 불안 유사 행동이 증가하였다. 쥐의 억제성 뉴런에서 Shank2의 삭제(Viaat-Cre)는 흥분성 뉴런 특이적 Shank2 녹아웃 마우스보다 더 강화된 그루밍이 관찰되었고, 더 적은 의사소통을 초래하였다.
ASD 환자에서 Shank1의 돌연변이도 발견되었다. ASD에 대한 첫 번째 Shank1 마우스 모델은 PDZ 도메인을 인코딩하는 엑손 14 및 15의 삭제를 통해 생성되었다. 엑손 14 및 15의 결실은 모든 Shank1 단백질 isoform의 완전한 knock-out을 초래하였다. 성체 Shank1 KO 마우스는 자가 그루밍 행동이 증가하였고, 불안 행동을 보였다. Shank1이 기억 유지에 역할을 함을 추측할 수 있는 맥락적 공포 기억 장애도 나타났다. Shank1 KO 마우스의 새끼는 어미와 격리되었을 때 상대적으로 적은 USV 호출을 보였다.
다양한 shank 돌연변이 마우스가 제작되었지만, 남아있는 다른 종류의 Shank 단백질이 Shank 단백질의 주요 기능을 커버할 수 있기 때문에 글루타메이트성 시냅스에서 Shank의 기능을 완전히 이해하기 위해서는 모든 Shank 유전자가 결실된 돌연변이 마우스가 필요하다. 그러나 3개의 유전자가 모두 동시에 결실된 마우스의 생성은 배아 단계에서 매우 치명적이어서 대부분 태어나기 전에 죽어버리기 때문에 성공하지 못했다. 최근에는 Shank1과 Shank3의 2개의 유전자만 삭제된 마우스가 생성되었다. Shank1-/- Shank3-/- DKO 마우스는 사회성 손상, 반복적 행동, 공간 학습 결핍, 낮은 생존율 및 dendritic spine의 현저한 감소를 포함한 심각한 행동 장애를 나타냈다 [4].
2.2.2. Shank 돌연변이 마우스에서의 분자적 연구
ASD의 발병기전에 관련된 시냅스 후 scaffolding 단백질의 기능적 연구는 주로 생화학적 및 전기생리학적 분석을 통해 흥분성 시냅스의 특성을 특성화하는 데 중점을 두었다. 모델 마우스에서 얻은 전기 생리학적 데이터는 글루타메이트성 시냅스 기능의 변화가 모든 Shank 돌연변이 마우스에서 발견되었음을 뒷받침하고 있다. Shank3E4-9 및 Shank3E21의 해마 CA1 영역에서 시냅스 전달이 감소하였으며, exon 9가 결여된 Shank3Δ9 마우스의 해마 CA1 시냅스에서 흥분성 전달이 감소하였다. 또한 Shank1 돌연변이 마우스에서는 기저 전달 및 소형 흥분성 시냅스 후 전류(mEPSC)가 감소하였다.
Shank 단백질의 기능을 밝히기 위한 다양한 연구에서 AMPA 및 NMDA 수용체 소단위 및 기타 scaffolding 단백질과 같은 시냅스 단백질들의 변화가 관찰되었다. Shank3 유전자에서 exon21의 결실은 해마의 PSD 분획에서 mGluR5의 증가를 일으키고, 엑손이 결여된 Shank3 돌연변이 마우스에서 GluA2, GluN2A, GluN2B, Homer1, PSD-93 및 SAPAP3/GKAP3가 감소하였다. Shank3 KO 마우스에서 mGluR5와 PSD-95가 striatum에서 증가했다. 또한, 코필린의 활성이 증가하고 Rac1/PAK 활성이 감소된 Shank3 KO 마우스에서 피질 액틴 필라멘트의 손실이 함께 발견되었다. 이러한 결과는 Shank3 돌연변이가 흥분성 시냅스의 구조와 기능에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다.
단일 유전자 돌연변이 마우스와 달리 Shank1-/- Shank3-/- DKO 마우스에서는 시냅스 글루타메이트 수용체의 구성에는 변화가 없었지만, Akt, S6, ERK1/2 및 eEF2를 포함하는 세포 내 신호 전달 경로의 활성화가 감소하였다. 그리고 Akt 인산화의 활성제로 알려진 코티닌을 생후(P) P14-P30 동안 투여하면 Shank1-/- Shank3-/- DKO 마우스에서 형태학적 및 행동적 결함이 회복되는 것을 관찰하였다.
Shank와 Homer의 상호 작용도 ASD와 관련이 있다고 알려져 있다. 호머 결합 부위가 결여된 Shank 돌연변이 생쥐는 사회적 상호작용의 손상을 나타내었고, 흥분성 시냅스에서 Shank 및 NR1의 양이 크게 감소했다. 단백질체 연구에서는 Homer-Shank 상호작용체가 항상성 가소성을 매개할 수 있음을 보여주었다. Homer1 또는 Shank3 유전자가 없는 마우스는 항상성 단백질 상호작용 네트워크(PIN) 변경이 나타나지 않아 결과적으로 시냅스 가소성이 손상되었다.
2.2.3. PSD-95 돌연변이 마우스
PSD-95는 막 관련 구아닐레이트 키나아제 패밀리(MAGUK)의 구성원이다. PSD-95는 NMDAR 및 AMPAR의 시냅스 후 막으로의 이동 및 안정화에 관여한다고 알려져 있다. 오래 전 연구에서 PSD-95가 ASD에 관여하는 고위험 유전자임을 밝혔으며, PSD-95 녹아웃 마우스는 반복적인 행동과 발성 감소를 포함한 자폐증 관련 행동 표현형을 나타냈다. 또한 PSD-95는 Shank, Homer, Neuroligin 및 FMR1을 포함한 ASD의 고위험 유전자와의 상호작용 네트워크에 관여한다고 알려져 있다. 뉴로리긴은 시냅스 기능과 시냅스 전달에 필수적인 단백질이다. Neuroligin1 돌연변이 쥐는 자가 그루밍 (self-grooming)이 증가함과 동시에 사회성 및 공간 학습 장애를 보였고, Neuroligin3 돌연변이는 공간 학습 능력은 증가했지만 사회성 손상을 초래했다. 또한, 보다 최근의 연구에서는 PSD-95가 Neuroligins/Neurexins에 의한 AMPA 수용체 클러스터링 및 기능의 조절에 필요하다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 발견은 ASD의 병태생리학 및 자폐증 치료 전략에 대한 추가적인 정보가 될 것이다.
3. 결론
모델 쥐를 이용한 연구는 분자 기능을 밝히고 질병의 치료 전략을 개발하는 데 필수적이다. 정신 장애와 관련된 마우스 모델을 사용한 연구는 행동 특성에서 위험 유전자의 기능을 밝히는 데 도움이 될 수 있다. 그러나 정신질환은 그 기전이 복잡하기 때문에 녹아웃 마우스 모델을 통해 단백질의 기능을 정의하는 것은 쉽지 않다. 이전에 설명했듯이 동일한 유전자를 표적으로 함에도 불구하고 일부 knock-out 모델은 다른 표현형을 보인다. PSD scaffolding 단백질은 여러 시냅스 기능과 관련이 있다. PSD scaffolding 단백질은 다른 PSD 단백질과의 단백질 상호 작용을 통해 분자 신호 및 기능에 관여하기 때문이다. 따라서 정신질환에 관여하는 PSD scaffolding 단백질의 기능을 연구하기 위해서는 PSD에서의 상호작용체를 조사하는 것이 중요하며, 발달 중인 이소형의 발현 영역과 기능에 대한 보다 자세한 연구가 필요하다. 최근에는 단백질체 분석을 통해 PSD의 상호작용체 변화와 정신 장애 사이의 상관 관계가 밝혀지는 연구가 증가하고 있다. 또한 PSD scaffolding 단백질의 필수 유전자를 표적으로 하는 이중 녹아웃 모델 마우스의 생성은 향후 연구를 위한 새로운 통찰력을 제공할 수 있다. 마지막으로, scaffolding 단백질의 돌연변이 마우스에 대한 연구는 다른 PSD 단백질 녹아웃 마우스의 현재 연구를 확장하고 치료 전략에 대한 새로운 표적을 제공할 수 있다.
정신장애 (psychiatric disorder)는 정신 질환, 정신 이상이라고도 하며, 개체의 생각, 행동, 인지능력에 영향을 준다. 정신장애에는 우울증, 양극성 장애, 정신 분열증 및 자폐증 등 다양한 종류의 질환이 포함된다. 이들 질환은 모두 의학적으로 다른 증세를 보이며 증세에 따라 서로 구별될 수 있다. 정신장애는 비정상적인 행동, 생각, 인지능력, 감정, 그리고 타인과의 사회적 교감의 조합에 의해 구별된다. 정신장애는 생물학적, 심리적, 환경적 요인이 복합적으로 작용하여 발생한다. 정신 장애의 병인을 설명하기 위해 인간 환자를 대상으로 한 여러 유전 연구에서 정신 장애의 발병과 관련된 잠재적 유전자를 확인할 수 있다. 최근까지 수행된 대규모 게놈 연구는 여러 개의 시냅스 후 유전자 세트에서 인간 정신 장애의 돌연변이를 발견하였는데, 이러한 발견을 통해 정신 장애와 관련된 유전적 돌연변이를 가진 모델 마우스를 생성할 수 있다. 정신 장애의 행동 특성을 탐구하는 유전적 마우스 모델은 근본적인 분자 메커니즘을 이해하고 장애의 치료 전략을 개발하는 데 유용한 도구이다. 예를 들어, Shank3 유전자는 자폐증이 있는 인간 환자의 유전자 연구를 통해 확인되었으며[1], Shank3 단백질은 실제로 마우스 모델을 통해 자폐증 (ASD)과 관련이 있다고 밝혀졌다.
시냅스 후 밀도 (postsynaptic density [PSD])는 흥분성 시냅스 (excitatory synapses)의 dendritic spines 내에 위치하는 거대한 복합체다. PSD는 scaffolding 단백질, 세포 접착 분자 (cell adhesion molecules), 신경전달물질 수용체 (neurotransmitter receptors), 막 수송 단백질 (membrane trafficking proteins) 및 세포골격 단백질 (cytoskeleton proteins)을 비롯한 수천 개의 단백질로 구성되어 있다[2]. PSD 단백질로 구성된 거대한 막 관련 단백질 복합체는 dendritic spines 형성, 시냅스 후 신호 전달 및 시냅스 가소성에 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다.
시냅스 후 scaffolding 단백질은 시냅스 신호 전달과 관련된 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 제공하는 PSD 단백질 복합체의 주요 구성요소이다. 많은 유전자 연구에서 시냅스 후 scaffolding 단백질의 돌연변이가 인간의 신경 및 정신 질환과 관련이 있음이 밝혀졌다. 시냅스 후 scaffolding 단백질을 제공하는 유전자의 돌연변이는 인간 정신 장애의 증상과 같은 비정상적인 사회적 행동 및 반복적인 일상을 포함한 행동 이상을 초래한다. 본 리포트에서 우리는 신경 발달 장애, 특히 자폐 스펙트럼 장애 (ASD)과 관련된 시냅스 후 scaffolding 단백질의 최근까지 연구된 돌연변이 쥐에 대해 정리하고자 한다. 모델 쥐의 행동 표현형과 이 단백질의 발병과 관련된 분자 기능에 대해서 함께 논의할 것이다.
2. 주요 내용
2.1. Postsynaptic density의 구조 및 scaffolding 단백질
신경계에서 시냅스는 화학적 신경전달물질의 방출과 작용을 통해 시냅스 전에서 시냅스 후 뉴런으로 전기 신호를 전달하는 데 필수적인 구조이다. 포유류의 뇌에서 대부분의 흥분성 시냅스(excitatory synapses)는 수상돌기를 따라 돌출된 부분에 위치하며, 이를 수상돌기(dendritic spines)라고 한다. 시냅스 후 밀도(PSD)는 흥분성 시냅스의 dendritic spines 내에 위치한 조밀한 영역으로, 디스크형 구조 단백질 복합체로 구성된다. PSD에 대한 단백질체 연구에 따르면 PSD에는 신경전달물질 수용체, 이온 채널, 신호전달 분자, 세포 부착 분자 및 scaffolding 단백질을 비롯한 수천 개의 별개의 단백질이 포함되어 있음이 밝혀졌다. PSD의 막 쪽에는 신경 전달 물질 수용체와 시냅스 간 접착 단백질이 포함되어 있다. 두 개의 글루타메이트 수용체, N-메틸-D-아스파르트산 수용체(NMDAR) 및 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속스-아졸프로피온산 수용체(AMPAR)는 PSD에 다량으로 분포하고 있다.
Postsynaptic scaffolding protein은 PSD에서 가장 많은 비중을 차지하는 단백질이다. Postsynaptic scaffolding 단백질은 PSD 단백질 간의 상호작용을 제공할 수 있는 거대한 동적 복합체를 형성하기 때문에, 시냅스 신호의 하위 전달 시 필수적인 역할을 한다고 알려져 있다. Postsynaptic scaffolding 단백질은 PSD95 family, SH3 및 multiple Ankyrin repeat domain (Shank) family, A-kinase anchoring protein (AKAP) family, the Homer family, 그리고 the SAP90/PSD95-associated protein (SAPAP) family 가 포함된다. Postsynaptic scaffolding protein은 단백질간 상호작용을 위해 잘 보존된 도메인을 가지고 있다. 따라서, Postsynaptic scaffolding protein의 결합 도메인을 통한 동적 복합체 및 특정 단백질-단백질 상호작용은 시냅스 신호 전달에 중요하다고 알려져 있다.
2.2. Postsynaptic scaffolding protein 과 자폐증과의 관계
CDC의 자폐증 및 발달 장애 모니터링(ADDM) 네트워크의 추정에 따르면, 자폐 스펙트럼 장애(ASD)는 미국 내 어린이 54명 중 1명에게 영향을 미치는 가장 널리 퍼진 신경 발달 장애다. ASD는 사회적 상호 작용 장애, 의사 소통 결함 및 반복 행동과 같은 임상적인 특징을 가진다. 자폐증의 진단은 아직까지 대부분이 행동으로만 정의되기 때문에 유전자 바이오마커를 이용하여 질병을 진단하기 위한 계속적인 노력이 있었다. 대량의 유전자 연구를 통해 ASD에 관여하는 다양한 후보 유전자가 확인되었는데, 그 중에서 잘 알려진 유전자는 시냅스 전 원형질막 단백질 (NRXN1-3), 시냅스 후 세포 접착 단백질 (NLGN1-3), 시냅스 후 scaffolding 단백질 (Shank1-3)이 있다. 이 단락에서는 ASD와 관련된 시냅스 후 scaffolding 단백질 돌연변이 쥐에 초점을 맞추어 알아보고자 한다. ASD의 행동 특성을 뒷받침하는 행동 표현형과 분자 메커니즘에 대해서 정리하였다.
2.2.1. SHANK mutant mice 의 행동적 특징
ProSAP로도 알려진 Shank 단백질은 글루탐산성 시냅스의 PSD에 위치한 거대한 scaffolding 단백질로, 시냅스 발달 및 기능에 필수적이라고 알려져 있다. Shank 단백질은 Shank1, Shank2 및 Shank3 유전자가 존재한다. 그 중 Shank3는 Phelan McDermid 증후군(PMS) 환자의 신경정신병적 증상과 관련하여 잘 알려진 유전자이다. 그 이후로 Shank3 de novo 돌연변이가 ASD 환자에서 처음 발견되었고, 다른 ASD 환자에서도 새로운 Shank3 돌연변이가 확인되었다. 현재까지 이루어진 연구들에서 3가지 Shank 유전자 모두의 돌연변이 또는 결실이 신경 발달 장애와 관련이 있음이 밝혀졌다. Shank1 유전자를 파괴하는 결실은 ASD 환자의 0.04%에서 발견되었으며, ASD에 특정한 de novo nonsense Shank2 돌연변이도 발견되었다.
Shank3 단백질은 뇌 영역, 발달 단계 및 세포 유형에 따라 다르게 발현되는 6개의 isoform을 가지고 있다[3]. 초기 연구에서 모든 Shank3 isoform을 제거하는 마우스를 만드는 데 실패하는 대신 Shank3 isoform이 없는 여러 Shank3 KO 마우스 라인이 특정 엑손의 돌연변이를 통해 생성되었다. 2010년부터 현재까지 Shank3 돌연변이 마우스는 고도로 보존된 PSD-95-Discs Large-zona occludens-1(PDZ) 도메인(Shank3E13-16), Ankyrin repeats 도메인(ANK)이 포함되는 엑손 4-9, 엑손 4-7, 엑손 9을 삭제하여 만들어졌다. 또한, SRC 상동성 3 도메인(SH3)(엑손 11) 및 Proline-rich domain (엑손21)이 결여된 마우스도 생성되었다. Shank3E13 마우스는 최근 엑손 12(E12)와 엑손 13(E13) 사이에 네오스톱 카세트를 삽입하여 생성되었다. 마지막으로 Shank3가 완전히 결여된 Knock-out 마우스 (엑손 4-22; Δe4–22-/-)가 최근에 보고되었다. 동일한 엑손 위치의 돌연변이에 대한 행동 테스트 결과는 세부적으로 보자면 다양하지만, 종합해보면 Shank3 KO 마우스는 일반적으로 반복적인 자기 손질 행동 (self-grooming), 사회적 상호 작용 장애 및 불안 유사 행동을 보인다. Shank3E13-16, Shank3E11 및 Δe4–22-/-(완전한 KO) 마우스는 자해적인 그루밍 행동을 나타냈다. 반면 마우스 Shank3E4-97 및 Shank3E 는 그루밍에서는 큰 변화가 없었다. Shank3 돌연변이 마우스는 Shank3E9와 Shank3E21을 제외하고는 대부분의 쥐가 사회적 능력과 상호작용이 손상되었다. 수컷이 암컷보다 ASD와 유사한 행동을 더 뚜렷하게 나타냄으로써, 사회적 상호작용에서 성별에 따른 차이를 보였다. Shank3의 엑손 4-9 및 Δe4-22-/- 마우스에서는 일반 쥐와는 구별되는 USV 패턴이 발견되었다. 형태학적으로 Shank3E4-9 및 Shank3E13-16 마우스에서 dendritic spine의 밀도가 감소하였으며, 길이도 짧아졌다. 이는 신경세포의 발달이 지연된다는 것을 보여준다. Shank3 돌연변이 마우스는 학습과 기억에서 다른 특징을 보였다. 예를 들어, Shank3E4-9, Shank3E11, Shank3E21 및 Δe4–22-/- 마우스는 MWM(Morris Water Maze test)를 수행하였을 때, 공간 학습에 대한 결함을 보였다. 이러한 서로 다른 특징은 Shank3의 subtype이 뇌에서 서로 다른 기능을 갖는다는 가설을 뒷받침하기도 한다.
두 종류의 Shank2 돌연변이 마우스가 각각 별개의 실험실에서 생성되었다. Shank2 유전자에서 exon 6-7 또는 exon 7의 유전적 결실은 모든 Shank2 isoforms의 완전한 결실을 초래하였다. 두 마우스 라인 모두 Shank2 isoform이 완전히 삭제된 모델이지만 ASD 관련 표현형에 대한 결과는 차이가 있었다. 엑손 7이 결여된 Shank2 KO 마우스 및 엑손 6-7이 결여된 Shank2 KO 마우스는 반복적인 행동을 보였다. 감소된 USV는 Shank2 KO 마우스 모두에서 발견되었다. 엑손 7이 결핍된 성체 Shank2 KO 마우스는 USV에서 음향 이상이 나타났으며 소리의 피크와 주파수가 모두 감소하였다. 엑손 6-7이 결여된 성체 Shank2 KO 마우스에서는 암수 상호작용 시 소리를 더 적게 내는 사실을 발견하였다. 감소된 dendritic spine의 밀도와 더 작은 PSD는 엑손 7이 삭제된 마우스에서만 발견되었다. 최근 보고된 연구에서는 해마와 striatum에서 시냅스 및 행동 표현형의 뚜렷한 변화가 관찰되었다. 흥분성 뉴런 특이적인 Shank2 녹아웃 수컷 마우스(CaMKII-Cre)는 명암 테스트에서 사회적 상호 작용이 감소하였으며, 사회적 의사소통이 경미하게 감소하고 불안 유사 행동이 증가하였다. 쥐의 억제성 뉴런에서 Shank2의 삭제(Viaat-Cre)는 흥분성 뉴런 특이적 Shank2 녹아웃 마우스보다 더 강화된 그루밍이 관찰되었고, 더 적은 의사소통을 초래하였다.
ASD 환자에서 Shank1의 돌연변이도 발견되었다. ASD에 대한 첫 번째 Shank1 마우스 모델은 PDZ 도메인을 인코딩하는 엑손 14 및 15의 삭제를 통해 생성되었다. 엑손 14 및 15의 결실은 모든 Shank1 단백질 isoform의 완전한 knock-out을 초래하였다. 성체 Shank1 KO 마우스는 자가 그루밍 행동이 증가하였고, 불안 행동을 보였다. Shank1이 기억 유지에 역할을 함을 추측할 수 있는 맥락적 공포 기억 장애도 나타났다. Shank1 KO 마우스의 새끼는 어미와 격리되었을 때 상대적으로 적은 USV 호출을 보였다.
다양한 shank 돌연변이 마우스가 제작되었지만, 남아있는 다른 종류의 Shank 단백질이 Shank 단백질의 주요 기능을 커버할 수 있기 때문에 글루타메이트성 시냅스에서 Shank의 기능을 완전히 이해하기 위해서는 모든 Shank 유전자가 결실된 돌연변이 마우스가 필요하다. 그러나 3개의 유전자가 모두 동시에 결실된 마우스의 생성은 배아 단계에서 매우 치명적이어서 대부분 태어나기 전에 죽어버리기 때문에 성공하지 못했다. 최근에는 Shank1과 Shank3의 2개의 유전자만 삭제된 마우스가 생성되었다. Shank1-/- Shank3-/- DKO 마우스는 사회성 손상, 반복적 행동, 공간 학습 결핍, 낮은 생존율 및 dendritic spine의 현저한 감소를 포함한 심각한 행동 장애를 나타냈다 [4].
2.2.2. Shank 돌연변이 마우스에서의 분자적 연구
ASD의 발병기전에 관련된 시냅스 후 scaffolding 단백질의 기능적 연구는 주로 생화학적 및 전기생리학적 분석을 통해 흥분성 시냅스의 특성을 특성화하는 데 중점을 두었다. 모델 마우스에서 얻은 전기 생리학적 데이터는 글루타메이트성 시냅스 기능의 변화가 모든 Shank 돌연변이 마우스에서 발견되었음을 뒷받침하고 있다. Shank3E4-9 및 Shank3E21의 해마 CA1 영역에서 시냅스 전달이 감소하였으며, exon 9가 결여된 Shank3Δ9 마우스의 해마 CA1 시냅스에서 흥분성 전달이 감소하였다. 또한 Shank1 돌연변이 마우스에서는 기저 전달 및 소형 흥분성 시냅스 후 전류(mEPSC)가 감소하였다.
Shank 단백질의 기능을 밝히기 위한 다양한 연구에서 AMPA 및 NMDA 수용체 소단위 및 기타 scaffolding 단백질과 같은 시냅스 단백질들의 변화가 관찰되었다. Shank3 유전자에서 exon21의 결실은 해마의 PSD 분획에서 mGluR5의 증가를 일으키고, 엑손이 결여된 Shank3 돌연변이 마우스에서 GluA2, GluN2A, GluN2B, Homer1, PSD-93 및 SAPAP3/GKAP3가 감소하였다. Shank3 KO 마우스에서 mGluR5와 PSD-95가 striatum에서 증가했다. 또한, 코필린의 활성이 증가하고 Rac1/PAK 활성이 감소된 Shank3 KO 마우스에서 피질 액틴 필라멘트의 손실이 함께 발견되었다. 이러한 결과는 Shank3 돌연변이가 흥분성 시냅스의 구조와 기능에 영향을 줄 수 있음을 나타낸다.
단일 유전자 돌연변이 마우스와 달리 Shank1-/- Shank3-/- DKO 마우스에서는 시냅스 글루타메이트 수용체의 구성에는 변화가 없었지만, Akt, S6, ERK1/2 및 eEF2를 포함하는 세포 내 신호 전달 경로의 활성화가 감소하였다. 그리고 Akt 인산화의 활성제로 알려진 코티닌을 생후(P) P14-P30 동안 투여하면 Shank1-/- Shank3-/- DKO 마우스에서 형태학적 및 행동적 결함이 회복되는 것을 관찰하였다.
Shank와 Homer의 상호 작용도 ASD와 관련이 있다고 알려져 있다. 호머 결합 부위가 결여된 Shank 돌연변이 생쥐는 사회적 상호작용의 손상을 나타내었고, 흥분성 시냅스에서 Shank 및 NR1의 양이 크게 감소했다. 단백질체 연구에서는 Homer-Shank 상호작용체가 항상성 가소성을 매개할 수 있음을 보여주었다. Homer1 또는 Shank3 유전자가 없는 마우스는 항상성 단백질 상호작용 네트워크(PIN) 변경이 나타나지 않아 결과적으로 시냅스 가소성이 손상되었다.
2.2.3. PSD-95 돌연변이 마우스
PSD-95는 막 관련 구아닐레이트 키나아제 패밀리(MAGUK)의 구성원이다. PSD-95는 NMDAR 및 AMPAR의 시냅스 후 막으로의 이동 및 안정화에 관여한다고 알려져 있다. 오래 전 연구에서 PSD-95가 ASD에 관여하는 고위험 유전자임을 밝혔으며, PSD-95 녹아웃 마우스는 반복적인 행동과 발성 감소를 포함한 자폐증 관련 행동 표현형을 나타냈다. 또한 PSD-95는 Shank, Homer, Neuroligin 및 FMR1을 포함한 ASD의 고위험 유전자와의 상호작용 네트워크에 관여한다고 알려져 있다. 뉴로리긴은 시냅스 기능과 시냅스 전달에 필수적인 단백질이다. Neuroligin1 돌연변이 쥐는 자가 그루밍 (self-grooming)이 증가함과 동시에 사회성 및 공간 학습 장애를 보였고, Neuroligin3 돌연변이는 공간 학습 능력은 증가했지만 사회성 손상을 초래했다. 또한, 보다 최근의 연구에서는 PSD-95가 Neuroligins/Neurexins에 의한 AMPA 수용체 클러스터링 및 기능의 조절에 필요하다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 발견은 ASD의 병태생리학 및 자폐증 치료 전략에 대한 추가적인 정보가 될 것이다.
3. 결론
모델 쥐를 이용한 연구는 분자 기능을 밝히고 질병의 치료 전략을 개발하는 데 필수적이다. 정신 장애와 관련된 마우스 모델을 사용한 연구는 행동 특성에서 위험 유전자의 기능을 밝히는 데 도움이 될 수 있다. 그러나 정신질환은 그 기전이 복잡하기 때문에 녹아웃 마우스 모델을 통해 단백질의 기능을 정의하는 것은 쉽지 않다. 이전에 설명했듯이 동일한 유전자를 표적으로 함에도 불구하고 일부 knock-out 모델은 다른 표현형을 보인다. PSD scaffolding 단백질은 여러 시냅스 기능과 관련이 있다. PSD scaffolding 단백질은 다른 PSD 단백질과의 단백질 상호 작용을 통해 분자 신호 및 기능에 관여하기 때문이다. 따라서 정신질환에 관여하는 PSD scaffolding 단백질의 기능을 연구하기 위해서는 PSD에서의 상호작용체를 조사하는 것이 중요하며, 발달 중인 이소형의 발현 영역과 기능에 대한 보다 자세한 연구가 필요하다. 최근에는 단백질체 분석을 통해 PSD의 상호작용체 변화와 정신 장애 사이의 상관 관계가 밝혀지는 연구가 증가하고 있다. 또한 PSD scaffolding 단백질의 필수 유전자를 표적으로 하는 이중 녹아웃 모델 마우스의 생성은 향후 연구를 위한 새로운 통찰력을 제공할 수 있다. 마지막으로, scaffolding 단백질의 돌연변이 마우스에 대한 연구는 다른 PSD 단백질 녹아웃 마우스의 현재 연구를 확장하고 치료 전략에 대한 새로운 표적을 제공할 수 있다.