신약개발에서 약물의 대사 및 약동학 특성의 최적화
2021-12-30
org.kosen.entty.User@3022eb19
이재현(jaelee122)
신약개발에서 약물의 대사 및 약동학 특성의 최적화
이재현, jaelee122@hanmail.net
한국산업기술진흥협회
Keywords
DMPK, ADME/T, Drug discovery and development, Pharmaceutical R&D efficiency, Optimization
약물대사 및 약동학, 흡수, 분포 대사 및 방출/독성, 신약개발 약제 R&D 효율, 최적화
1. 서론
신약개발에서, 최적 약물대사 및 약동학(drug metabolism and pharmacokinetics, DMPK) 특성들은 약물 후보들이 전임상에서 임상 단계까지 진행하는 모든 단계에 영향을 끼친다. DMPK는 신약 연구, 개발에 중심 규율로서 후보 물질이 임상 단계까지 진행할지 말지를 확인하는 중요 결정요소이다. 실제로 DMPK는 지난 20여 년간 신약개발의 성공률을 증가시켜왔다.[1, 2] DMPK에 의한 성공률에의 공헌 및 개선에는 3가지 이유가 있다. 첫째, DMPK는 현재 초기 약물 발견에 일상적으로 사용된다. 이는 15~20년 전부터 시작되었다. 둘째 DMPK 과학자들은 약물대사 효소들, 운반체들, 그리고 종 및 인간들 사이의 차이를 더 잘 이해한다. 많은 연구 도구들 및 발달한 기기들이 활용되어 인간과 동물들의 in vitro와 in vivo 데이터들을 비교적 쉽게 예측할 수 있다. 셋째, 적절한 DMPK 특성을 최적화할 수 있는 방법들이 형성되고, 개량되어 약제 개발에 응용되고 있다.
한편, 다음 그림 1[3]에서 보듯이 흡수, 분포, 대사 및 배설/독성(absorption, distribution, metabolism and excretion/toxicity, ADME/T)은 약제 개발에 매우 중요하다. 실제로 in vitro 및 in vivo 모델에서 얻은 ADME/T 변수들은 환자들에서 약물의 동태를 예측할 수 있어 약제 개발을 중지하든지, 더 진행할 것인지 결정하는 데 중요 요인이다. 그러나 ADME/T 데이터의 부정확한 연구나 오역은 약제 개발의 실패를 자초한다. ADME/T의 연구는 in vitro, in vivo 혹은 in silico 모델에서 수행한다.
* DDI = Drug and drug interaction
그림 1. 전형적인 약제 개발 과정
2. DMPK 특성의 최적화
DMPK 특성을 최적화하면 R&D 파이프라인에 있는 선도 화합물의 임상 단계 도중 개발의 포기를 최소화한다. 선도 화합물의 최적화에서 여러 DMPK 특성이 결정된다. 즉 예를 들면 in vitro ADME/T 특성 및 in vivo PK의 물리화학적 특성(용해도, 친지방성 및 투과율 등)이 결정된다(표 1[4] 참조). 약제들은 간에서 1단계 간 효소에 의하여 대사된다. 여기서 이들은 산화, 환원 혹은 가수분해되어 더 극성을 띠게 된다. 관여하는 효소들은 시토크롬 P450(CYP450) 효소의 아형들로 CYPprefix에 의해 확인하며 서열 번호, 큰 글자 및 번호로 표시된다. 첫 숫자는 과를 표시하고 글자는 아형과를, 그리고 마지막 숫자는 각 효소의 발견 서열을 의미한다. 인간에는 57개의 CYP450 아형이 존재하며, 의미 있는 것들은 CYP3A4, CYP1A2, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19[5]이다.
？
표 1. 화합물 DMPK 특성을 평가하는 절차
선도 화합물의 최적화 DMPK와 안전성 프로파일을 선택하는 데 추가하여, 약물 후보자들과 여러 운반체 간의 가능한 상호작용이 또한 중요하다. 운반체들은 멤브레인에 부착된 단백질[6]로 약물을 세포들 내외로 운반하는 등 약물 처리에 매우 중요한 역할을 한다. 약물 운반체들에는 2개의 과가 있다. 즉 ATP-결합 카세트(ATP-binding cassette, ABC), 유출 운반체[즉, P-glycoprotein(pgp)] 및 담즙염 방출 펌프(bile salt export pump, BSEP), 그리고 용질 운반(solute carrier, SLC)이며, 또 약물 흡수 운반체(즉 유기 음, 양이온 운반체), 소듐-의존 taurocholate[7] 및 폴리펩타이드 공동 운반체 등이다. 후보 물질들의 약물 운반체들에 대한 효과는 매개에 대한 흡수, 배출을 결정함으로써 DDI를 예측하기 위하여 조사된다.
In vivo PK 연구는 전임상 동물모델들에서 약제 후보의 ADME/T 특성을 결정하여 임상 단계로 진행하는 데 중요한 역할을 한다. 이들 연구로부터 약제 후보들의 인간등가선량(human equivalent dose, HED) 및 관찰되지 않은 부작용 레벨(no- observed adverse-effect level, NOAEL)이 결정된다[8]. 추가하여 이들 연구들은 PK/pharmcodynamic(PK/PD) 운영인자들의 이해를 돕는다. 통상적인 PK 변수들은 곡선 밑 면적(area under the curve, AUC), 방출, 반감기(t1/2), 특정 공간에서의 분포 부피, 새로운 화합물의 최대혈액농도 및 최저농도 등이다.
PK 연구의 첫 단계는 방법 개발과 약제 후보들을 확인하고 수를 파악하며 혈액, 혈청, 플라스미드 그리고 소변과 같은 이들의 특정 생리 매체에서 대사물들을 파악하는 것이다. 방법은 Interna-tional conference of Harmonisation(ICH), FDA, 혹은 약전 지시 내용을 따른다. PK 연구의 중요한 점은 혈량과 부작용 사이의 관계를 약량-반응 커브 사이의 관계로 결정하는 것이다. 약물과 사람 사이의 PK 차이를 알고 나면 PK 연구는 적어도 3개의 다른 동물들 중에서 수행한다. 또 독성 키네틱스를 PK의 일부로 독성 연구의 시간 경로를 결정한다. 치료 약량보다 높은 약량을 투여하여 이후 약제 개발 단계 기간의 약량과 약제의 안정성 범위를 측정한다.[9]
3. 약제 개발에서 DMPK의 중요도
몇몇 주요 제약회사들에서 후보 약제의 개발 중단을 분석한 것이 있다.[10, 11] 1991년에는 40%가 불충분한 DMPK 특성으로 개발 중단되었다. 이 현상은 2000년에는 10% 이하로 줄었다. 이러한 중단의 역전은 이 분야에서 DMPK의 중요성을 일깨워준다. DMPK 연구의 이해는 약제의 개선으로 이어졌다.
그림 2. 약제의 ADME 개선. 대사로 약물의 활성을 나타내는 Prodrug를 붉은색으로 표시함.
상기 그림 2[12]에서 terfenadine, 비진정성 히스타민은 1985년에 시장에 나왔는데, 심장독성 때문에 1997년에 시판이 중단되었다. 그러나 이 약제의 x-산화 산물인 fexofenadine은 심장독성이 없으면서 약효는 terfenadine과 같았다. 따라서 이 물질은 1996년에 시장에 나왔다. 다발성경화증 치료제 dimethyl fumarate(DMF)는 친전자성이며 MetID 연구로 monomethyl fumarate(MMF)가 활성 대사산물로 알려졌다. 반면 dimethyl fumarate(DMF)는 친전자성이 적어 위장에서 내성이 좋다. 두 약제는 2020년도에 시판되기 시작하였다. 마크로라이드계 항생제 erythromycin은 1972년에 시판되었다. 이의 간단한 화학개질(Beckmann rearrangement)로 azithromycin이 만들어졌는데, 이 약제는 분포 부피가 개선되고 약효가 증가하였으며 반감기가 더 길었다. 이는 1988년도에 시판되기 시작하였다.
4. DMPK 모델링 및 모의실험
DMPK 평가기술은 지난 세기 동안 크게 발전하여 활성 장소에서의 노출 정보, 표적 정보와 표적 노출 및 표적과의 관계 등의 약학적인 지식이 넓어졌다. 표적 활성 장소에서의 약제 PK의 중요성은 최근 논문에 잘 발표되었다.[13] 이 논문에는 자유 약물의 이해, 약물 농도 측정의 어려움, 활성 장소에서 약물 운반체들의 역할은 물론이고, 뇌, 폐, 종양, 대장 등의 관심 장소에서 약물의 노출 예상을 논하고 있다.
이렇게 새로운 방법과 절차들이 소개되어 좀 더 완전한 DMPK 양상을 평가하게 되었다. The Pharmaceutical Research and Manufacturers of America(PhRMA)에 의한 업계 간 계획은 약물 개발 단계에서 DMPK의 실행 방법을 잘 설명하고 있다.[14]. 따라서 모델링 및 모의시험은 약제 개발에 필수적인 절차이다. 기존 데이터들은 시간과 비용을 절약하여 제품 안정성 및 약제 용량 등을 이해하는 데 중요한 통찰력을 주고 있다. 이들 정보는 예를 들면 인간 첫 번째(first-in-human, FIH) 임상 또는 특정 인종들에서 임상실험에서 약량을 선택하게 하고 결과를 예상하게 한다.
5. 결론
DMPK 과학은 신약개발에 중심 역할을 한다. 약제 R&D 효율은 DMPK를 통한 후보 약제는 정확한 ADME/T의 예측에서 온다. 현재 전임상 단계에서 FDA의 승인을 받는 약제는 약 12%이다. 추가하여 많은 약제들이 시판 중단되는데, 이는 불충분한 ADME/T 특성 때문이다. “Hit”에서 선도 화합물(H2L) 단계에서 여러 in vitro DMPK 시험이 수행되며, 이어서 임상에 들어가기 전 최적화 연구가 진행된다. 대사 연구들은 활성, 효능, 안정성, 독성 및 가능한 약물 상호작용을 제공한다. 예를 들면 어떤 약제의 대사산물은 원래 약제보다 더 강한 효능을 나타내어 대사산물이 약제가 되기도 한다. 대사반응은 약제 후보의 민감한 기능 그룹과 링커에 대한 정보를 제공하여 개선된 후보 약제를 설계하는 데 도움이 된다.
요즘 신약개발 파이프라인에서 DMPK 연구는 초기 단계, 즉 H2L 단계 및 선도 화합물이 최적화에 적용되어 어떤 약제가 동물시험과 임상시험에 들어갈지를 결정한다. 임상에서 높은 포기율과 시판 약제의 리콜에 대비해 어떤 후보 물질이 임상까지 진전할지를 결정하려면 효능과 안정성의 DMPK 연구가 필수적이다. 이 리뷰가 신약개발 연구자들에게 도움이 되기를 바라며, 이곳에서 다룬 자료들이 약제 개발 효능에 도움이 되기를 바란다.
References
1. DiL, Kerns EH. Profiling drug-like properties in discovery research. Curr Opin Chem Biol 2003;7:402？8.
2. Kerns EH, Di L. Pharmaceutical profiling in drug discovery. Drug Discov Today 2003;8:316？23.
3. Donglu Zhang et al., Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development, Acta Pharmaceutica Sinica B 2012;2(6):549？561.
4. Kit-Kay Mak et al., Drug Discovery Today, 2021.
5. G. Redlich, U.M. Zanger, S. Riedmaier, N. Bache, A.B. Giessing, M. Eisenacher, et al., Distinction between human cytochrome P450 (CYP) isoforms and identification of new phosphorylation sites by mass spectrometry, J Proteome Res 7 (11) (2008) 4678？4688.
6. Y. Li, Q. Meng, M. Yang, D. Liu, X. Hou, L. Tang, et al., Current trends in drug metabolism and pharmacokinetics, Acta Pharm Sin B 9 (6) (2019) 1113？1144.
7. D.K. Sevior, O. Pelkonen, J.T. Ahokas, Hepatocytes: The powerhouse of biotransformation, Int J Biochem Cell Biol 44 (2) (2012) 257？261.
8. J. Ning, L. Chen, I.M.C.M. Rietjens, Role of toxicokinetics and alternative testing strategies in pyrrolizidine alkaloid toxicity and risk assessment; state-of-the-art and future perspectives, Food Chem Toxicol 131 (2019) 110572.
9. J. Ning, L. Chen, I.M.C.M. Rietjens, Role of toxicokinetics and alternative testing strategies in pyrrolizidine alkaloid toxicity and risk assessment; state-of-the-art and future perspectives, Food Chem Toxicol 131 (2019) 110572.
10. I. Kola, J. Landis, Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?, Nat Rev Drug Discov 3 (8) (2004) 711？715.
11. J. Waring, J. Arrowsmith, A.R. Leach, P.D. Leeson, S. Mandrell, R.M. Owen, et al., An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies, Nat Rev Drug Discov 14 (7) (2015) 475？486.
12. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2021.11.005.
13. M.L. Rizk, L. Zou, R.M. Savic, K.E. Dooley, Importance of drug pharmacokinetics at the site of action, Clin Transl Sci 10 (3) (2017) 133？142.
14. M. Davies, R.D.O. Jones, K. Grime, R. Jansson-Lofmark, A.J. Fretland, S. Winiwarter, et al., Improving the accuracy of predicted human pharmacokinetics: lessons learned from the AstraZeneca drug pipeline over two decades, T
이재현, jaelee122@hanmail.net
한국산업기술진흥협회
Keywords
DMPK, ADME/T, Drug discovery and development, Pharmaceutical R&D efficiency, Optimization
약물대사 및 약동학, 흡수, 분포 대사 및 방출/독성, 신약개발 약제 R&D 효율, 최적화
1. 서론
신약개발에서, 최적 약물대사 및 약동학(drug metabolism and pharmacokinetics, DMPK) 특성들은 약물 후보들이 전임상에서 임상 단계까지 진행하는 모든 단계에 영향을 끼친다. DMPK는 신약 연구, 개발에 중심 규율로서 후보 물질이 임상 단계까지 진행할지 말지를 확인하는 중요 결정요소이다. 실제로 DMPK는 지난 20여 년간 신약개발의 성공률을 증가시켜왔다.[1, 2] DMPK에 의한 성공률에의 공헌 및 개선에는 3가지 이유가 있다. 첫째, DMPK는 현재 초기 약물 발견에 일상적으로 사용된다. 이는 15~20년 전부터 시작되었다. 둘째 DMPK 과학자들은 약물대사 효소들, 운반체들, 그리고 종 및 인간들 사이의 차이를 더 잘 이해한다. 많은 연구 도구들 및 발달한 기기들이 활용되어 인간과 동물들의 in vitro와 in vivo 데이터들을 비교적 쉽게 예측할 수 있다. 셋째, 적절한 DMPK 특성을 최적화할 수 있는 방법들이 형성되고, 개량되어 약제 개발에 응용되고 있다.
한편, 다음 그림 1[3]에서 보듯이 흡수, 분포, 대사 및 배설/독성(absorption, distribution, metabolism and excretion/toxicity, ADME/T)은 약제 개발에 매우 중요하다. 실제로 in vitro 및 in vivo 모델에서 얻은 ADME/T 변수들은 환자들에서 약물의 동태를 예측할 수 있어 약제 개발을 중지하든지, 더 진행할 것인지 결정하는 데 중요 요인이다. 그러나 ADME/T 데이터의 부정확한 연구나 오역은 약제 개발의 실패를 자초한다. ADME/T의 연구는 in vitro, in vivo 혹은 in silico 모델에서 수행한다.
* DDI = Drug and drug interaction
그림 1. 전형적인 약제 개발 과정
2. DMPK 특성의 최적화
DMPK 특성을 최적화하면 R&D 파이프라인에 있는 선도 화합물의 임상 단계 도중 개발의 포기를 최소화한다. 선도 화합물의 최적화에서 여러 DMPK 특성이 결정된다. 즉 예를 들면 in vitro ADME/T 특성 및 in vivo PK의 물리화학적 특성(용해도, 친지방성 및 투과율 등)이 결정된다(표 1[4] 참조). 약제들은 간에서 1단계 간 효소에 의하여 대사된다. 여기서 이들은 산화, 환원 혹은 가수분해되어 더 극성을 띠게 된다. 관여하는 효소들은 시토크롬 P450(CYP450) 효소의 아형들로 CYPprefix에 의해 확인하며 서열 번호, 큰 글자 및 번호로 표시된다. 첫 숫자는 과를 표시하고 글자는 아형과를, 그리고 마지막 숫자는 각 효소의 발견 서열을 의미한다. 인간에는 57개의 CYP450 아형이 존재하며, 의미 있는 것들은 CYP3A4, CYP1A2, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19[5]이다.
？
표 1. 화합물 DMPK 특성을 평가하는 절차
선도 화합물의 최적화 DMPK와 안전성 프로파일을 선택하는 데 추가하여, 약물 후보자들과 여러 운반체 간의 가능한 상호작용이 또한 중요하다. 운반체들은 멤브레인에 부착된 단백질[6]로 약물을 세포들 내외로 운반하는 등 약물 처리에 매우 중요한 역할을 한다. 약물 운반체들에는 2개의 과가 있다. 즉 ATP-결합 카세트(ATP-binding cassette, ABC), 유출 운반체[즉, P-glycoprotein(pgp)] 및 담즙염 방출 펌프(bile salt export pump, BSEP), 그리고 용질 운반(solute carrier, SLC)이며, 또 약물 흡수 운반체(즉 유기 음, 양이온 운반체), 소듐-의존 taurocholate[7] 및 폴리펩타이드 공동 운반체 등이다. 후보 물질들의 약물 운반체들에 대한 효과는 매개에 대한 흡수, 배출을 결정함으로써 DDI를 예측하기 위하여 조사된다.
In vivo PK 연구는 전임상 동물모델들에서 약제 후보의 ADME/T 특성을 결정하여 임상 단계로 진행하는 데 중요한 역할을 한다. 이들 연구로부터 약제 후보들의 인간등가선량(human equivalent dose, HED) 및 관찰되지 않은 부작용 레벨(no- observed adverse-effect level, NOAEL)이 결정된다[8]. 추가하여 이들 연구들은 PK/pharmcodynamic(PK/PD) 운영인자들의 이해를 돕는다. 통상적인 PK 변수들은 곡선 밑 면적(area under the curve, AUC), 방출, 반감기(t1/2), 특정 공간에서의 분포 부피, 새로운 화합물의 최대혈액농도 및 최저농도 등이다.
PK 연구의 첫 단계는 방법 개발과 약제 후보들을 확인하고 수를 파악하며 혈액, 혈청, 플라스미드 그리고 소변과 같은 이들의 특정 생리 매체에서 대사물들을 파악하는 것이다. 방법은 Interna-tional conference of Harmonisation(ICH), FDA, 혹은 약전 지시 내용을 따른다. PK 연구의 중요한 점은 혈량과 부작용 사이의 관계를 약량-반응 커브 사이의 관계로 결정하는 것이다. 약물과 사람 사이의 PK 차이를 알고 나면 PK 연구는 적어도 3개의 다른 동물들 중에서 수행한다. 또 독성 키네틱스를 PK의 일부로 독성 연구의 시간 경로를 결정한다. 치료 약량보다 높은 약량을 투여하여 이후 약제 개발 단계 기간의 약량과 약제의 안정성 범위를 측정한다.[9]
3. 약제 개발에서 DMPK의 중요도
몇몇 주요 제약회사들에서 후보 약제의 개발 중단을 분석한 것이 있다.[10, 11] 1991년에는 40%가 불충분한 DMPK 특성으로 개발 중단되었다. 이 현상은 2000년에는 10% 이하로 줄었다. 이러한 중단의 역전은 이 분야에서 DMPK의 중요성을 일깨워준다. DMPK 연구의 이해는 약제의 개선으로 이어졌다.
그림 2. 약제의 ADME 개선. 대사로 약물의 활성을 나타내는 Prodrug를 붉은색으로 표시함.
상기 그림 2[12]에서 terfenadine, 비진정성 히스타민은 1985년에 시장에 나왔는데, 심장독성 때문에 1997년에 시판이 중단되었다. 그러나 이 약제의 x-산화 산물인 fexofenadine은 심장독성이 없으면서 약효는 terfenadine과 같았다. 따라서 이 물질은 1996년에 시장에 나왔다. 다발성경화증 치료제 dimethyl fumarate(DMF)는 친전자성이며 MetID 연구로 monomethyl fumarate(MMF)가 활성 대사산물로 알려졌다. 반면 dimethyl fumarate(DMF)는 친전자성이 적어 위장에서 내성이 좋다. 두 약제는 2020년도에 시판되기 시작하였다. 마크로라이드계 항생제 erythromycin은 1972년에 시판되었다. 이의 간단한 화학개질(Beckmann rearrangement)로 azithromycin이 만들어졌는데, 이 약제는 분포 부피가 개선되고 약효가 증가하였으며 반감기가 더 길었다. 이는 1988년도에 시판되기 시작하였다.
4. DMPK 모델링 및 모의실험
DMPK 평가기술은 지난 세기 동안 크게 발전하여 활성 장소에서의 노출 정보, 표적 정보와 표적 노출 및 표적과의 관계 등의 약학적인 지식이 넓어졌다. 표적 활성 장소에서의 약제 PK의 중요성은 최근 논문에 잘 발표되었다.[13] 이 논문에는 자유 약물의 이해, 약물 농도 측정의 어려움, 활성 장소에서 약물 운반체들의 역할은 물론이고, 뇌, 폐, 종양, 대장 등의 관심 장소에서 약물의 노출 예상을 논하고 있다.
이렇게 새로운 방법과 절차들이 소개되어 좀 더 완전한 DMPK 양상을 평가하게 되었다. The Pharmaceutical Research and Manufacturers of America(PhRMA)에 의한 업계 간 계획은 약물 개발 단계에서 DMPK의 실행 방법을 잘 설명하고 있다.[14]. 따라서 모델링 및 모의시험은 약제 개발에 필수적인 절차이다. 기존 데이터들은 시간과 비용을 절약하여 제품 안정성 및 약제 용량 등을 이해하는 데 중요한 통찰력을 주고 있다. 이들 정보는 예를 들면 인간 첫 번째(first-in-human, FIH) 임상 또는 특정 인종들에서 임상실험에서 약량을 선택하게 하고 결과를 예상하게 한다.
5. 결론
DMPK 과학은 신약개발에 중심 역할을 한다. 약제 R&D 효율은 DMPK를 통한 후보 약제는 정확한 ADME/T의 예측에서 온다. 현재 전임상 단계에서 FDA의 승인을 받는 약제는 약 12%이다. 추가하여 많은 약제들이 시판 중단되는데, 이는 불충분한 ADME/T 특성 때문이다. “Hit”에서 선도 화합물(H2L) 단계에서 여러 in vitro DMPK 시험이 수행되며, 이어서 임상에 들어가기 전 최적화 연구가 진행된다. 대사 연구들은 활성, 효능, 안정성, 독성 및 가능한 약물 상호작용을 제공한다. 예를 들면 어떤 약제의 대사산물은 원래 약제보다 더 강한 효능을 나타내어 대사산물이 약제가 되기도 한다. 대사반응은 약제 후보의 민감한 기능 그룹과 링커에 대한 정보를 제공하여 개선된 후보 약제를 설계하는 데 도움이 된다.
요즘 신약개발 파이프라인에서 DMPK 연구는 초기 단계, 즉 H2L 단계 및 선도 화합물이 최적화에 적용되어 어떤 약제가 동물시험과 임상시험에 들어갈지를 결정한다. 임상에서 높은 포기율과 시판 약제의 리콜에 대비해 어떤 후보 물질이 임상까지 진전할지를 결정하려면 효능과 안정성의 DMPK 연구가 필수적이다. 이 리뷰가 신약개발 연구자들에게 도움이 되기를 바라며, 이곳에서 다룬 자료들이 약제 개발 효능에 도움이 되기를 바란다.
References
1. DiL, Kerns EH. Profiling drug-like properties in discovery research. Curr Opin Chem Biol 2003;7:402？8.
2. Kerns EH, Di L. Pharmaceutical profiling in drug discovery. Drug Discov Today 2003;8:316？23.
3. Donglu Zhang et al., Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development, Acta Pharmaceutica Sinica B 2012;2(6):549？561.
4. Kit-Kay Mak et al., Drug Discovery Today, 2021.
5. G. Redlich, U.M. Zanger, S. Riedmaier, N. Bache, A.B. Giessing, M. Eisenacher, et al., Distinction between human cytochrome P450 (CYP) isoforms and identification of new phosphorylation sites by mass spectrometry, J Proteome Res 7 (11) (2008) 4678？4688.
6. Y. Li, Q. Meng, M. Yang, D. Liu, X. Hou, L. Tang, et al., Current trends in drug metabolism and pharmacokinetics, Acta Pharm Sin B 9 (6) (2019) 1113？1144.
7. D.K. Sevior, O. Pelkonen, J.T. Ahokas, Hepatocytes: The powerhouse of biotransformation, Int J Biochem Cell Biol 44 (2) (2012) 257？261.
8. J. Ning, L. Chen, I.M.C.M. Rietjens, Role of toxicokinetics and alternative testing strategies in pyrrolizidine alkaloid toxicity and risk assessment; state-of-the-art and future perspectives, Food Chem Toxicol 131 (2019) 110572.
9. J. Ning, L. Chen, I.M.C.M. Rietjens, Role of toxicokinetics and alternative testing strategies in pyrrolizidine alkaloid toxicity and risk assessment; state-of-the-art and future perspectives, Food Chem Toxicol 131 (2019) 110572.
10. I. Kola, J. Landis, Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?, Nat Rev Drug Discov 3 (8) (2004) 711？715.
11. J. Waring, J. Arrowsmith, A.R. Leach, P.D. Leeson, S. Mandrell, R.M. Owen, et al., An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies, Nat Rev Drug Discov 14 (7) (2015) 475？486.
12. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2021.11.005.
13. M.L. Rizk, L. Zou, R.M. Savic, K.E. Dooley, Importance of drug pharmacokinetics at the site of action, Clin Transl Sci 10 (3) (2017) 133？142.
14. M. Davies, R.D.O. Jones, K. Grime, R. Jansson-Lofmark, A.J. Fretland, S. Winiwarter, et al., Improving the accuracy of predicted human pharmacokinetics: lessons learned from the AstraZeneca drug pipeline over two decades, T