KOSEN 한인과학기술자네트워크

>안녕하세요? 회원님들! >제가 실험하고자 하는 것은 A 단백질의 수용체를 확인하기 위하여 cell >lysates를 Biotin으로 labelling한 다음 Immunoprecipitation하여 western >blot으로 detect하고자 합니다. >1) 이때 Biotin을 어떻게 labelling하는지, >2) 대부분의 사람들은 Iodine을 사용하던데 무엇이 다른지 >3) 2차 항체로는 Streptavidin, Horseradish peroxidase conjugate를 >사용하여 ECL (Amersham사)로 detect하는 것이 맞는지 >그리고 이 A 단백질 수용체의 추정되어지는 binding site를 합성하여 >Affinity >chromatography를 하고싶은데 이때 사용되어지는(?)인 DSS >(Pierce사)를 녹이는 용액은 무엇인지, 어떻게 사용하는지 등등.. >정확한 개념이 없어서 질문이 이상할지도 모르겠습니다. >관련된 Protocol이나 technique에 조언을 주실분을 기다리겠습니다. >끝까지 읽어주셔서 감사합니다. > 제일먼저 이글을 읽고나서 묻고 싶은것은 A라는 단백질의 antibody를 만들고자 하는가입니다. 만일 antibody 없이 계속 실험을 하게 된다면 많은 문제점을 직면하게 될것입니다. 특히 질문에서와 같이 biotinylation을 이용하게되면 아시다시피 불특정하게 total soluble proteins을 얻게되고 Western을 하더라도 원하는 단백질을 정확하게 구별해 낼수 없읍니다. 만일 이 단백질의 cDNA가 용이하다면 간단히 molecular tag (such as 6xHis, c-myc, flag, etc..)을 이용하면 좋으리라 생각됩니다. 질문상의 biotin labeling은 Pierce에서 제공하는 (또는 다른 회사) 여러가지형태의 cross-linker를 달고있는 biotin을 이용 단백질의 N- 또는 C-terminus에 붙일수있읍니다. 말씀하신대로 2차 항체로는 streptavidin에 HRP가 붙어있는 것이면 됩니다. affinity column을 펩타 드를 가지고 만드신다고 하셨는데, 일단 합성된 펩타이드를 sepharose/agarose 같은 beads에 conjugation을 시킬려면 cross-linker가 필요합니다. 그 펩타이드의 방향 (amine or carboxyl)에 따라 서로 다른 linker를 쓸수있읍니다. DSS는 그중하나인데, linker가 반드시 수용성일 필요는 없을수도 있읍니다. 원하는 reaction에 따라 많은 linker들을 이용할수 있음. DSS의 경우는 primary amine을 이용하는데 DMSO에다 녹여쓸수 있음(10-25mM). 하지만 꼭 DSS를 이용할 필요는 없다고 생각합니다. 다른 옵션들도 많이 있읍니다. 질문에 도움이 되는 답변을 제공해 드렸는지 궁금합니다. 또다른 질문사항이 있으면 알려주십시요.