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>proteomics의 핵심기술 >그리고 구체적인 이용에 관하여 자료를 주시면 감사하.... KOSEN에서 첨부한 자료가 이해하기 쉽게 잘 나와 있어서 읽어 보시면 proteomics에 대한 개념이나 구체적인 이용법에 대해 쉽게 이해하실 수 있으리라 생각됩니다. 단, proteomics의 핵심기술인 2차원 전기영동법 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis) 이나 질량분석법 (mass spectrometry) 에 대한 보다 자세한 개념이나 구체적인 이용사례에 대해서는 아래의 논문들을 참조하시기 바랍니다. 먼저 2차원 전기영동법에 대한 최근의 연구논문들 및 리뷰를 첨부하였고 이어 질량분석법에 대한 연구논문들, 그리고 마지막으로 이 두 가지 방법을 사용하여 연구논문을 첨부하였습니다. 도움이 되시길 바랍니다. 1. Characterization of proteins in latex of the opium poppy (Papaver somniferum) using two-dimensional gel electrophoresis and microsequencing. Electrophoresis 2000 Oct;21(16):3345-50 Decker G, Wanner G, Zenk MH, Lottspeich F Max Planck Institute for Biochemistry, Analytical Protein Chemistry Group, Martinsried, Germany. decker@biochem.mpg.de The opium poppy (Papaver somniferum) belongs to the group of latex-containing plants. Latex is the milky-like fluid within laticifer cells. In this study, poppy latex was analyzed with respect to ultrastructure, alkaloid, and protein content. The main goal of this project was the examination of the proteins by two-dimensional gel electrophoresis. In a proteomics approach, we investigated two main fractions of the latex, namely the cytosolic serum and the sedimented fraction containing the alkaloid-accumulating vesicles. Of the serum, representing the protein-rich part of the latex, 75 spots were analyzed by internal peptide microsequencing, followed by a database searching. For 69 proteins a function could be assigned due to homology to known proteins, whereas six spots could not be identified. Furthermore, codeinone reductase, a representative of the specific enzyme system in morphine biosynthesis, could be detected within the cytosolic serum fraction. In the vesicle-containing pellet, 23 protein spots were analyzed. An attempt was also made to separate the vesicle pellet by density centrifugation, followed by investigation of the alkaloid content, ultrastructure, and protein pattern. This study describes the first database of soluble proteins present in the latex of P. somniferum 2. Observations on the reproducibility and matching efficiency of two-dimensional electrophoresis gels: consequences for comprehensive data analysis. Electrophoresis 2000 Oct;21(16):3345-50 Voss T, Haberl P Boehringer-Ingelheim, Vienna, Austria. tilman.voss@vie.boehringer-ingelheim.com Protein expression profiling by proteomics has the potential to be an ideal tool for the description of changes in complex biological systems or in the characterization of a disease. This study analyzes in more quantitative terms how methodological drawbacks of the current technology can hamper the comprehensive analysis of large sets of spot patterns by statistical means. Irreproducibilities in spot intensities due to silver staining and geometric distortions of the spot patterns inherent to the electrophoresis procedure push even the semiautomatic alignment and matching to their limits. This leads to reduced matching efficiencies for identical spots if no additional exhaustive manual matching is performed for every single spot in all gels. As a consequence, only a limited number of spots can be matched in all gels of a large set. The statistical pattern analysis of such data sets will thus not allow the comprehensive description of relevant pattern changes. 3. Quantitative evaluation of protein recoveries in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 2000 Aug;21(14):3035-47 Zuo X, Speicher DW The Wistar Institute, Philadelphia, PA 19104, USA. In this study, metabolically radiolabeled Escherichia coli cell extracts were used to systematically evaluate protein recoveries at each step of two-dimensional (2-D) electrophoresis and using different sample application methods. Sample application using sample cups resulted in better protein recovery compared with sample loading by rehydration when the Multiphor system was used. At least 50% or more of an E. coli extract was lost when high protein amounts (500 microg) were loaded by rehydration using this system, which employs separate holders for rehydration and isoelectric focusing (IEF). In contrast, when the IPGphor system was used, rehydration sample loading consistently yielded the highest overall protein recoveries. These improved protein recoveries were due to integration of rehydration and electrophoretic separation in a single unit. Even at high protein loads (500 microg), less than 15-20% of the proteins were lost when proteins were loaded by rehydration using sample buffer containing 2% carrier ampholytes in the ceramic immobilized pH gradient (IPG) strip holders used for both rehydration and IEF. Regardless of the loading conditions used, carrier ampholytes in the sample buffer increased protein recoveries. Use of thiourea did not significantly affect protein recoveries but did improve protein resolution in 2-D gels as expected. In summary, these results show the best protein recoveries are obtained for all protein loads when samples are applied to IPG strips during rehydration using a single device for both rehydration and IEF. In contrast, the poorest recoveries are obtained when rehydration and IEF are performed in separate devices, and losses increase dramatically with increasing protein loads using this approach. 4. MALDI-TOF mass spectrometry in protein chemistry. EXS. 2000;88:81-97 Roepstorff P Department of Molecular Biology, Odense University, Denmark. Mass spectrometry has in the last decade been accepted as a key analytical technique in protein chemistry. It is now the preferred technique for identification of proteins separated by one- or two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, i.e. in proteome analysis. It is the dominating technique for determination of posttranslational modifications in proteins. The two ionization techniques presently widely used in protein studies are matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) in combination with time-of-flight (TOF) mass analyzers and electrospray ionization (ESI) in combination with a variety of mass analyzers. In this chapter the principles and performance of MALDI-TOF mass spectrometry will be described as well as the application of this technique to a variety of applications. 5. Trends Biotechnol 2000 18(2):77-84 Single-nucleotide polymorphism analysis by MALDI-TOF mass spectrometry. Griffin TJ, Smith LM Department of Molecular Biotechnology, University of Washington, Box 357730, Seattle, WA 98195-7730, USA. tgriffiin@u.washington.edu Single-nucleotide polymorphisms (SNPs) have great potential for use in genetic-mapping studies, which locate and characterize genes that are important in human disease and biological function. For SNPs to realize their full potential in genetic analysis, thousands of different SNP loci must be screened in a rapid, accurate and cost-effective manner. Matrix-assisted laser desorption-ionization-time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry is a promising tool for the high-throughput screening of SNPs, with future prospects for use in genetic analysis. 6. Proteome mapping by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis in combination with mass spectrometric protein sequence analysis. EXS. 2000;88:1-27 Appella E, Arnott D, Sakaguchi K, Wirth PJ Laboratory of Cell Biology, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA. The high resolving power of two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis 2D-PAGE and its full analytical and preparative potential have been described with special emphasis on reproducibility and standardization of protein spot patterns, enhanced protein detection sensitivity, and computer analysis database development. New methodologies for peptide mass fingerprinting, peptide, sequence, and fragmentation tagging have been highlighted. Major challenges associated with 2D-PAGE/mass spectrometric protein sequencing were outlined which need to be addressed in the future, including sample enrichment, use of alternative gel matrices, improvements in separation systems interfaced directly to the mass spectrometer, and design of high-sensitivity instruments with very high mass ranges. It is hoped that comparative studies to identify, quantitate, and characterize proteins differentially expressed in normal versus diseased cells would give insight into mechanisms of pathogenesis and allow the development of a way to control both the etiology and the course of diseases.

* 프로테오믹스의 핵심 기술(첨부된 파일'프로테오믹스의 연구방향과 국내 프로테오믹스 연구의 활성화' 에서 발췌한 것으로 첨부된 파일을 참고하시기 바랍니다.관련 사이트도 참고하시기 바랍니다.) 1) 단백질 질량분석기술 프로테오믹스의 시작점인 단백질 생화학은 한때 매우 느리고 어려운 일로 여겨져 왔다. 단백질 연구가 유전자 연구보다 매우 느린 이유는 DNA 처럼 대량증폭이 불가능하고 비교적 용액상에서 불안정하여 기능을 쉽게 잃는데다 조직에서의 분리 정제가 매우 어려워 정제된 단백질을 사용하여 연구해야 하는 일 (예, 약리성 호르몬 단백질, 펩타이드성 약물 등)에는 그만큼 적용이 더디었다. 이러한 데에는 단백질 자체가 생합성후의 변형이 매우 다양하여 일률적인 추출, 분리, 정제방법이 적용되기 어려웠기 때문이기도 하다. 한 단백질의 정제에 보통 수년간의 시간이 소요됨은 당연한 이치이다. 일찍이 지금처럼 기술적으로 단백질의 복잡한 정제과정 대신 2-D gel로 분석하여 표적 단백질을 분리하고, MALDI-TOF 과 QTOF 질량분석기로 attomole (10-18) 수준의 극미량의 단백질을 할 수만 있었어도 유전체학분야처럼 매우 발달되어 있었을 것이다. 프로테옴 기술이 보다 널리 활용되고 급속히 변해가는 관련기술을 수용키 위해서는 보다 공통기반적인 기반 기술이 필요하다. 즉, 유전체학 (Genomics)에서 DNA의 증폭기술 (PCR)이 일종의 게놈구조결정의 전환점이 된 것처럼 단백질도 무엇인가 그런 핵심적(Core)이고 기반적인(platform) 기술이 필요했다. 이것이 바로 위에서 언급한 2-D gel을 이용한 분석기술이고, MALDI-Mass 분석기술이라고 본다. 이중에서도 2-D gel 전기영동은 매우 정교한 단백질 분리기술인데도 불구하고 분석용외에는 분리정제용 목적으로 사용되지 않은 탓에 현재의 프로테오믹스 구성분처럼 큰 기능을 못하였다. 단백질의 화학적인 분자량 측정에는 다른 작은 생체분자들처럼 MALDI 와 ESI (분무이온화법)이 있다. MALDI는 2D-gel 상에 분리된 단백질을 trypsin 으로 가수분해하여 얻은 단일전하를 띈 이온화된 펩타이드를 분석하는 기법이다. ESI 방법은 정제된 시료를 이온화 시켜 (다중전하등) 분석하는 방법으로 LC 등 컬럼크로마토그라피와 연결시켜 사용할 수 있다. 효과적인 MALDI 분석을 위하여는 질소레이저(337 nm)를 사용, 분석대상물질의 비행시간을 측정하여 각각의 mass (m/z)를 분석하는 TOF 형 (MALDI-TOF) 이 활용된다. 2) Preparative 2D 프로테오믹스 분야에서 가장 중요한 발전은 2-D gel을 "preparative" 용도로 사용하기 시작한 것으로 여기에다 고정화된 pH gradient 기술이 접목이 되면서 매우 빠르게 프로테오믹스 기술이 진전되기 시작하였다. 이와 더불어 2-D gel용 sample 추출방법과 densitometer에 의한 image 분석이 개발되면서, 이 2-D gel은 매우 빠른 속도로 발전하기 시작하였다. 프로테옴기술의 핵심중 하나는 앞서 언급했듯이 전통적인 단백질 생화학 기술로서 이미 26년전에 사용되기 시작했던 2-D 전기영동 기술이다. 즉, 단백질의 pH 등전점 (pI)으로 나타내는 net charge에 따라 제1차 분석을 한 후 (1D), 이어서 분자량에 따라 분리하는 (2D) 방법이다. 이 기술을 사용하면 분석 대상 단백질 sample을 세포의 특정 생리 조건에 따라 제조하여 특정 spot에 대한 분리 양상을 지도로 구성할 수 있다. 여기서 나타난 연구대상의 특정 spot의 단백질을 적당한 크기로 자르고, 이것들을 trypsin을 사용하여 단편조각들로 만든 후 위에서 언급한 MALDI-TOF등의 단백질 질량 분석기로 분석하여 아미노산 서열을 결정하고, 이를 바탕으로 단백질이나 genome data base를 bioinformatics tool로 찾아 이 단백질의 정체를 확인하는 연속된 과정이다. 이후의 일은 이 단백질의 신규성과 기능을 알게된 cDNA로 찾아 세포내에서 과다 발현시켜 in vitro assay (효소분석)를 하거나 해당 유전자의 knock-out 동물이나 변이 세포를 사용하여 그 유전자의 기능을 in vivo에서 검정 (target validation) 한다. 문제는, 이렇게 발견된 단백질의 신규성 (novelty) 여부와 이것의 기능이 얼마나 다양한지를 밝히는 일인 것이다.* 프로티오믹스(Proteomics)의 槪念 및 發展動向, 이대실, 바이오인더스트리 22 아래의 자료는 산업기술정보원(http://www.kiniti.re.kr)에서 검색된 자료입니다. 참고자료가 되실 겁니다. 웹을 통해 원문신청이 가능합니다. * 프로티오믹스(Proteomics)의 槪念 및 發展動向, 이대실, 바이오인더스트리 22(”99.8):pp.2-7 * 인간 게놈에 대한 미국의 연구 실태와 방향, 정수일, 기술관리 (KOR) (205), P21-25, 2000; 초록 : 인간 유전자 프로젝트(HGP)는 미국의 셀레라 지노믹스사의 여러 과학자와 많은 집단이 관여하였고 미국 NIH가 계획한 연구가 진행되어 인간 유전자 서열 분석의 종료 시점인 듯이 발표를 하였으나 아직도 인간 유전자 분석은 끝마쳐야 할 일이 많다. 인간 게놈에 대한 상세한 유전학적 지도를 완성하기 위해서 생물학적, 의학적 연구 기반을 전제로 하는 국제적인 연구 프로그램이었던 HGP는 인간 RNA의 구조, 성상, 작용뿐만 아니라 인간의 발생과 생체 기작의 새로운 방향을 제시하였다. 향후 인간 게놈을 연구하는 과학자들은 분자 수준에서 인간의 건강과 질환을 다루게 될 것이고 각종 난치성 질환을 극복하거나 진단하기 위해서 일할 것이다. 인간 게놈 연구와 더불어 구조 게놈학, 일명 프로테오믹스(Proteomics)가 연구되고 있다. 미국의 NIGM(The Institute of General Medical Science)는 프로테오믹스 연구에 2천만 달러를 투입할 것으로 알려지고 있는데 이는 향후 유용한 기능성을 가진 수많은 유형의 단백질이 연구 결과물로 탄생하는 것을 예고하는 것이다. >proteomics의 핵심기술 >그리고 구체적인 이용에 관하여 자료를 주시면 감사하....