2004-05-28
org.kosen.entty.User@12d1a882
백승연(sybaik)
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안녕하세요.
두 단백질간의 interaction을 보고자 immunoprecipitation을 수행하고 있습니다.
이 target 단백질은 세포에서 endogeneous하게 발현합니다. western에서 발현이 확인되었습니다,.
그런데 total protein 500ug 으로 IP를 수행하였는데, 항체와 결합하지 않습니다...
다른 IP 실험에서는 transfection해서 target 단백질 발현을 증가시켜 IP를 수행하던데...
꼭 target 단백질의 유전자를 세포에 넣어 발현시켜 IP를 수행해야 하는지요?
조직에서 target 단백질의 IP를 위해서 5mg 단백질을 사용하던데...이 정도 양은 돼야 IP가 돼나요?
- Immunoprecipitation
- interaction
- association
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답변 2
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답변
고은진님의 답변
2004-05-29- 0
>아시겠지만 일단 사용하신 항체가 IP가 가능한 항체인지 확인해보십시오. target단백질의 양이 어느정도 필요한지는 잘 모르겠습니다만 아주 적게 발현하는 단백질이라면 처음 시작하는 sample의 양을 많이 사용하면 되겠지요. 제가 했던 단백질들은 overexpression하지 않아도 IP가 가능했습니다. 또한 IP의 조건시 사용하는 buffer의 종류중 detergent의 종류를 다르게 바꾸어가며 조건을 잡으실 것을 권합니다. 이를테면 stringent condition, mild condition이 그것인데 Na-deoxycholate와 같은 detergent가 들어간 RIPA buffer일경우 stringent condition에 속합니다. 또한 IP과정에서 washing할 때 PBS에 0.1% tween 20정도의 mild condition으로 수행해보십시오. 단백질에 따라 결합이 매우 약한 것들이 있기 때문에 다른 논문에서 똑같은 단백질 상호작용을 본 것들이 있다면 그 논문의 조건을 참고해보십시오. 좋은 하루 되세요. -
답변
전주홍님의 답변
2004-07-05- 0
첫째 항체가 구조를 특이적인것이 아니라 아미노산 서열에 특이적일 경우 denaturing condition에서 항원을 인식할 수 있지만 natural conformation 일 경우 epitope이 노출이 안되어서 ip가 잘 안될 수 있습니다. 둘째 항체의 epitope 부분이 생체내의 다른 단백질과의 interaction에 의해 masking이 되어 있을 수 있습니다. 이를 경우 보통 cell extract의 양을 늘리거나 항체의 양을 늘려서 극복할 수 있지만 false-positive 를 항상 염두해 두어야 겠죠.. 셋째 IP 기술은 생체내에서 만들어진 단백질을 이용하는 것이 가장 좋은 system이 되겠지요... overexpression system은 세포내의 환경을 변화시키 고 non-specific protein-protein interaction이 증가되기 때문에 차선책 으로 사용하는게 좋을 듯 합니다.