KOSEN 한인과학기술자네트워크

>제가 1년동안 cloning을 못하고 있습니다... 정말 괴롭습니다... 제가 하는 방법이 directional cloning을 하고 있습니다... > > primer 1: kpn 1을 포함하고 있는 프라이머 > primer 2: xho 1을 포함하고 있는 프라이머 > pcr product : 570bp > primer enzyme site 앞에 여분의 염기 첨가(catalog 참조) > >pcr은 해서 밴드가 확인이 됩니다... > >vector: pET32a(+) 이걸 kpn 1과 xho 1으로 짤라서 ligation 시킵니다... > >cpcell : DH5a 을 사용하고요... positive control도 같이해서 사용합니다...아무 문제 없고요... > >정작문제는 colony가 안뜨거나 떠도 나중에 plasmid prep 해보면 band가 보이지 ？蚌윱求？.. 밴드가 보여도 원래 백터보다 사이즈가 적어서 다시 enzyme 처리를 하면 엉뚱한넘이 있습니다... > >대략 이러한 사항입니다.... > >혹시 클로닝에 도통한 박사님들 이글을 보시면 좀 조언좀 해주세요... 어떠한 조언이라도 겸허이 받아들여 수용하겠습니다... 거의 제가 혼자 머리 싸매서 책보구 고칠려고 하니 한계에 다르더군요... 실험이라는게 책대로 다해서 나오면 대학원생들이 고생하지는 않겠지요... 만약 추가로 물으실것이 있으시다면 메일보내주시면 넘 감사해서 바로 알려드리겠습니다... 저 좀 도와주세요.... > > 당연히 인서트 안에 kpn/xho I은 없겠죠? 클로닝 하시면 일단 콜로니 PCR을 통해서 인서트 사이즈를 확인하세요. 아시겠지만 콜로니 PCR은 이쑤시개나 팁으로 콜로니 한번 찍어서 다시 키우기 위해 새로운 배지에 한번 찍은후 PCR튜브에 넣고 흔들어주고 처음 했던 PCR조건에서 20사이클만 하시면 됩니다. 이게 제대로 안되면 굳이 잘라볼 필요도 없습니다. 그 이전 단계 문제니까요. 엔자임 처리나 ligation 조건은 이것저것 안해본게 없을 것 같군요. 따라서 공정을 최대한 간편하게 줄이는 것이 도움이 될 것 같습니다. 젤일루션이나 페놀 추출같은거 하지마시고 되도록 DNA purification키트 사서 간단하게 하도록 하세요. 저희 랩에서도 클로닝을 많이하지만 국산 프라이머들이 그렇게 나쁜 편은 아닌 것 같습니다. 하지만 정 안될때는 새로운 엔자임 사이트를 갖는 Vector, 프라이머 디자인을 포함해서 모든 material을 바꿔봐야죠. 심지어 본인의 손도... (다른사람에게 부탁). 그리고 일년씩 고생하는 것보다는 돈을 더 주고서라도 Gateway 같은 편리한 시스템을 써보세요. 일단 실험을 진행하는 것이 더 낫다고 생각하고 또 나중에 다른 유전자로 다시해보면 쉽게 되기도 한답니다.

도움이 될지는 모르겠지만 일단 대답을 남깁니다. 첫째, Primer를 어느 제조회사에 의뢰했는지 모르겠습니다. 개인적으로는 invitrogen에 주로 의뢰합니다. 조금 비싸지만은 주문한 염기서열과 다르게 나오는 적은 한번도 없었습니다. 국내회사에 주문했다가 여러번 실패한 경험이 있었습니다. primer를 chemical synthesis를 하다가 나오는 error인 것 같은데 특정 염기서열의 substitution, deletion, insertion이 일어난 경우가 종종 있었거든요 이런 경우에도 low strigent condition에서는 PCR이 잘 됩니다. (물론 한번씩 열받아서 PCR product를 T-vector에 집어넣고 sequencing을 해서 primer의 sequence를 확인했었죠...). 둘째, cloning이 잘안되면 PCR을 한 후 DNA polymerase(Taq...)을 제거한 후 enzyme digestion을 하는 과정이 중요할 수도 있죠. PCR 용 DNA polymerase의 특성을 보면 고온에서 안정하다는 거죠...그말은 왠만한 단백질은 변성이 되는 온도에서 DNA 합성을 한다는 것은 구조적으로 매우 안정하고 DNA에 결합하는 능력이 대단하다는 거죠...그래서 PCR 한 후 PCIA/CIA extraction, EtOH precipitation을 거친 후 digestion을 하는 것도 efficiency를 증가시키는 하나의 방법이죠. 셋째, ligation 전 agarose gel electrophoresis 과정을 포함시키는 protocol을 사용한다면 UV의 효과도 한번 쯤 생각해 보셔야겠죠... 특히 UV lamp로 DNA를 관찰할 때 UV에 의한 adduct이 발생합니다. 근데 adduct에 따라서 E. coli내에서 repair가 안되는 경우가 많기 때문에 Ligation product가 세포안으로 들어가더라도 replication이 안일어나는 경우가 발생합니다. 특히 UV 단파일때가 더욱 심하죠...이러한 내용은 예전에 Biotechniques라는 Journal에 여러번 소개된 바 있습니다. 넷째, Ligation 후 65도에서 15분(온도와 시간이 정확히 기억나지는 않네요) 정도 방치하면 ligase가 inactivation 되는데 이런 후 transformation을 하면 transformation efficiency가 증가한다는 논문도 발표된 바 있습니다. 만약 ligation 자체가 의심스러우면 정량적으로 확인하긴 힘들겠지만 vector 상에 상보적인 primer를 이용하여 PCR로 ligation 여부를 확인할 수 있겠죠... 일단 일반적인 대답을 남겼는데 혹시 다른 질문이 있으면 좀 더 discussion을 했으면 좋겠네요... >제가 1년동안 cloning을 못하고 있습니다... 정말 괴롭습니다... 제가 하는 방법이 directional cloning을 하고 있습니다... > > primer 1: kpn 1을 포함하고 있는 프라이머 > primer 2: xho 1을 포함하고 있는 프라이머 > pcr product : 570bp > primer enzyme site 앞에 여분의 염기 첨가(catalog 참조) > >pcr은 해서 밴드가 확인이 됩니다... > >vector: pET32a(+) 이걸 kpn 1과 xho 1으로 짤라서 ligation 시킵니다... > >cpcell : DH5a 을 사용하고요... positive control도 같이해서 사용합니다...아무 문제 없고요... > >정작문제는 colony가 안뜨거나 떠도 나중에 plasmid prep 해보면 band가 보이지 ？蚌윱求？.. 밴드가 보여도 원래 백터보다 사이즈가 적어서 다시 enzyme 처리를 하면 엉뚱한넘이 있습니다... > >대략 이러한 사항입니다.... > >혹시 클로닝에 도통한 박사님들 이글을 보시면 좀 조언좀 해주세요... 어떠한 조언이라도 겸허이 받아들여 수용하겠습니다... 거의 제가 혼자 머리 싸매서 책보구 고칠려고 하니 한계에 다르더군요... 실험이라는게 책대로 다해서 나오면 대학원생들이 고생하지는 않겠지요... 만약 추가로 물으실것이 있으시다면 메일보내주시면 넘 감사해서 바로 알려드리겠습니다... 저 좀 도와주세요.... > >

움...그 심정 이해가 갑니다. 2-3일이면 되야 될 당연한 클로닝이 안되니..쩝쩝.....제가 아는 모 유명대학교수님도 박사과정 내내 클로닝 한개 만은 못하고 졸업하셨지요. 정말 안되는 것도 있긴 있는것 같습니다. 현재 생각에는 발현이 되면 세포에 치명적인 유전자로 추정을 할 뿐입니다. 앞의 답을 참조로 경험담을 위주로 하나씩 이야기를 풀겠습니다. 1) 보통 올리고나 키트, 제한효소 등은 는 별 문제가 없습니다. 콜로니가 안 뜬다고 하였으니, 제한효소의 양쪽 끝에 있는 링커의 길이가 충분한지만 확인해 보세요. 통상적으로 DNA정제는 키트로 정제하는 것보다 페놀로 정제하는 것이 좋습니다. 그리고 앞에 분이 언급했듯이, UV 단파장은 실험이 안 될 경우에는 정말 치명적입니다. 단파장 많이 쬐면 콜로니가 안나오거나 나와도 변형이 생깁니다. 실험이 1년이나 안되었다면 이것 저것 다 바꾸어보았을터이니, 이건 당근 확인하였을테니, 그냥 한번 확인만 해 보십시요. 혹시 바로 제한효소 처리해서 클로닝을 했다면, PCR amplified DNA fragment를 pAT 벡터에 한번 넣었다가 빼어 내면서, DNA sequencing도 한번 해보고 (올리고 확인), insert에는 문제가 없다는 것을 정확히 확인 할 필요는 있겠습니다 (아래의 “3)벡터의심“ 참조). 2)생각해야 할것은 유전자의 성질이지요. 이 유전자의 성질이 뭡니까? 혹시 전사인자? 이거 잘 클로닝 안되는 경우가 많습니다. 이럴 경우에는 똑같은 유전자를 대장균이 아닌 효모나 인섹트 세포에서 한번 해 보십시요.. 아니면 대장균에서 발현이 안되는 아주 원시적인 클로닝 벡터를 써서 한번 대조실험을 해 보세요 (pTZ or pUC etc). 그렇게 클로닝이 안되면, 아마도 세포내에서 중요한 역할을 수행할 수도 있는 단백질로 추정이 되니, 좋은 논문 쓸 수 있다는 희망을 버리지 마십시요. 3) 마지막으로 균주와 벡터를 의심하는 경우입니다. 균주는 다른 것 클로닝할때 사용했다면 문제가 없겠고요.. 벡터의 경우에는 의심할 만 합니다. 저희 랩도 어떤 종류의 pET로 클로닝이 안되서 다른 종류의 pET로 바꾸어서 사용한 적이 있습니다. 4) 결론적으로, 콜로니가 안나오는 것으로 보아서 전체적인 소견은 벡터에 의심이 갑니다. 아니면 유전자가 발현이 조금이라도 되면 대장균이 죽는것이던지요.. 그럼 Good Luck! 대전에서 >제가 1년동안 cloning을 못하고 있습니다... 정말 괴롭습니다... 제가 하는 방법이 directional cloning을 하고 있습니다... > > primer 1: kpn 1을 포함하고 있는 프라이머 > primer 2: xho 1을 포함하고 있는 프라이머 > pcr product : 570bp > primer enzyme site 앞에 여분의 염기 첨가(catalog 참조) > >pcr은 해서 밴드가 확인이 됩니다... > >vector: pET32a(+) 이걸 kpn 1과 xho 1으로 짤라서 ligation 시킵니다... > >cpcell : DH5a 을 사용하고요... positive control도 같이해서 사용합니다...아무 문제 없고요... > >정작문제는 colony가 안뜨거나 떠도 나중에 plasmid prep 해보면 band가 보이지 ？蚌윱求？.. 밴드가 보여도 원래 백터보다 사이즈가 적어서 다시 enzyme 처리를 하면 엉뚱한넘이 있습니다... > >대략 이러한 사항입니다.... > >혹시 클로닝에 도통한 박사님들 이글을 보시면 좀 조언좀 해주세요... 어떠한 조언이라도 겸허이 받아들여 수용하겠습니다... 거의 제가 혼자 머리 싸매서 책보구 고칠려고 하니 한계에 다르더군요... 실험이라는게 책대로 다해서 나오면 대학원생들이 고생하지는 않겠지요... 만약 추가로 물으실것이 있으시다면 메일보내주시면 넘 감사해서 바로 알려드리겠습니다... 저 좀 도와주세요.... > >

위의 답변 이외에 transformation한 뒤에 agar plate에 세포를 spreading할 때 얼마나 했는지는 모르겠지만 colony수가 정작 적다면 transformation한 cell suspesion을 centrifugation하여 volume을 줄여 약 200 ul로 만든후 이것을 모두 깔아보세요. 이렇게 해서 생긴 colony를 키워서 prep해보세요. 저의 경우 mutant만들때 colony수가 너무 적고 그나마 생긴 것을 prep했을 때 이상한 사이즈가 나오거나 하면 이렇게 했었는데 그래도 많은 colony가 나오진 않았지만 제대로 된 것을 찾을 수 있었지요. 행운을 빕니다.

1. Size가 이상할 때; 제가 inverted repeat을 가지는 부분을 cloning할 때 겪은 일인데 이상하게도 plasmid의 size가 줄어드는 경우가 거의 100%였습니다...나중에 알고보니 repeat 부분이 조금이라도 존재하면 recombination이 아주 활발하게 일어난다는 paper가 나와있더군요.. Insert가 vector와 homology가 있거나 아니면 insert 내에 repeat이 존재하면 대개 그렇습니다. 2. plasmid가 잘 안 뽑힐 때; prep하여 band가 안보이더라도 다시 transformation하심이 좋을 듯 하네요. 나중에 colony PCR로 가장 잘 뜨는 clone을 사용하여 prep하시면 보다 많은 양의 plasmid를 얻을 수 있습니다. 3. Bacteria에 toxic하다??; Expression vector에서 종종 나타날 수 있다지만..저의 경험 상 대부분 그렇지 않더군요..결론은 host cell이나 vector를 교환하였을 때 제대로 expression도 되고 prep도 잘 되었어요...