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gene vs gene으로 Y2H를 하신 것 아마도 protein-protein interaction을 verify하기 위해 하신 것으로 보입니다. Y2H를 interaction을 검증하거나 interacting domain mapping의 도구로도 많이 사용하죠... library screening을 하실 때도 기본적인 개념은 말씀하신데로 gene vs gene로 하셨을 때와 동일합니다. 그러나 보통 100만 이상의 diversity를 가진 library를 screening 하는 것은 또 다른 factor들을 고려하셔야 됩니다. 1. Library amplification Transformation method를 이용하여 library screening을 계획하시는 것 같은데요... 일단 library의 가장 큰 특징 중의 하나는 개개의 cDNA는 random fragment로써 size가 제각각 이라는 것이죠... 이것을 E.coli에 집어 넣고 culture를 하게되면 size각 작은 prey vector를 가진 E.coli가 outgrowth되는 패턴이 나타납니다. 그래서 library amplification을 할 때는 liquid culture를 하지 않고 먼저 E.coli를 plating 한 후 (보통 100 mm dish 100개 정도는 하죠...^^) 다음날 plate의 E.coli를 모우고 잠깐 subculture 한 후 DNA를 뽑죠... 여기서 library amplification의 의미는 쉽게 말하면 diversity의 증가가 아니라 library DNA 양의 증가는 의미합니다. 결국 DNA를 얻기 위해서는 E.coli를 배양해야 하고 그러면 DNA의 양은 amplify가 되는 거죠... 위에서 언급했듯이, liquid culture를 많이 하면 size가 큰 plasmid를 가진 E.coli는 dilution-out이 많이 되기 때문에 조심해야 합니다. 2. Transformation efficiency가 무지 중요합니다. 일반적으로 library는 100만 diversity 정도이기 때문에 이를 모두 test하려면 적어도 1000 만 개를 screening해야 합니다. 예를 들면 50 ug의 DNA를 사용하면 1000만 개의 yeast colony가 나와야 되는 효율성을 의미합니다. 이렇게 되어야만 library에 존재하는 모든 종류의 cDNA를 모조리 확인해 볼 수 있습니다. 3. Selection 쉽게 표현하면 protein-protein interaction은 affinity에 따라 binding 되는 정도가 다 다릅니다. 그러나 affinity가 biological significance를 나타내는 건 아니기 때문에 Y2H에서 signal이 약해도 중요한 interacting partner를 잡아낼 수 있습니다. 문제는 ade selection인데, kinetics 측면에서 보면 his 의 겨우 transcriptional activation이 잘 되는 반면 ade 의 경우 activation이 느리게 일어납니다. 그러므로 4DO를 바로 사용하면 affinity가 약한 prey를 놓칠 확률이 커집니다. 또한 4D0 selection은 library screening의 경우 2 주이상 배양하기도 합니다. 시간적으로도 너무 오래 배양하기 때문에 agar plate도 두껍게 굳혀야 되고 그러죠... 그래서 저는 개인적으로 his positive colony를 선별한 후, ade selection 단계로 넘어갑니다. 자세히 말하자면 오래시간이 걸리니까 여기서 이만 줄이겠습니다. 도움이 되시길 바랍니다. >안녕하세요 > >한가지 궁금하게 있어서 질문 올립니다.... >제가 yest two hybrid를 해본 사람인데.. 전 gene vs gene으로 각각을 bait, prey에 넣어서 하였습니다.. > >근데 지금은 cDNA library가 prey에 들어가 있다고 하는데 >어떻게 해야 할지를 모르겠습니다.. >library를 amplify 하라는대 이게 무슨 말인지도 모르겠습니다.. > >그냥 gene vs gene 하는 방식으로 똑같이 >E.coli에서 plamid 뽑아서 yeast 에 co-transformation하여 >4DO에 나오는거 prey 로 시퀀싱 해보면 되는거 아닌가요?? > >아시는 분들 상세한 답변들 부탁드립니다..

>안녕하세요>>한가지 궁금하게 있어서 질문 올립니다....>제가 yest two hybrid를 해본 사람인데.. 전 gene vs gene으로 각각을 bait, prey에 넣어서 하였습니다..>>근데 지금은 cDNA library가 prey에 들어가 있다고 하는데>어떻게 해야 할지를 모르겠습니다..>library를 amplify 하라는대 이게 무슨 말인지도 모르겠습니다..>>그냥 gene vs gene 하는 방식으로 똑같이 >E.coli에서 plamid 뽑아서 yeast 에 co-transformation하여>4DO에 나오는거 prey 로 시퀀싱 해보면 되는거 아닌가요??>>아시는 분들 상세한 답변들 부탁드립니다.. >Re: 참고자료