2005-05-01
org.kosen.entty.User@7fa85f72
이광순(ibega)
- 2
잘 모르겠는 것이 있어 여쭤봅니다... 답변 부탁 드립니다...
cell line(adhesion cell)을 이용하여 culture한 후에 trypsin-EDTA로 cell을 떨군후에 PBS로 washing하였습니다...
1% Triton X-100을 포함하는 PBS로 현탁한후 freezing-thawing 하였습니다...
Centrifugation(15000 rpm, 15 min)을 통해 pellet과 supernatent를 분리한후 두가지 모두 전기영동을 하여 western을 시행하였습니다...
결과는 pellet에서만 나타나는데 detergent insoluble한 protein은 세포내에서 어떠한 형태를 하고 있는지?? 또는 세포내의 어디에 위치하고 있는지??에 대해 알고 계시는분 답변부탁드립니다...
(단, lipid raft에 관여하는 protein은 아니었습니다...)
좋은 하루 되시고 답변 부탁드리겠습니다...
- detergent insoluble
- pellet
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
전주홍님의 답변
2005-05-01- 0
단백질의 solubility는 참 어려운 문제인 것 같습니다. 일반적으로 water insoluble protein들은 lipid membrane과 상호작용을 하는 경우가 많지만 cytosolic protein이면서도 test tube에서는 insoluble 형태를 띠는 경우도 종종 관찰할 수 있습니다. 이런 경우 물리화학적 특징인 solubility가 시사하는 생리학적 의미가 무엇인지는 간단히 해결할 수 있는 문제는 아닌 듯 합니다. Triton X-100은 mild, nonionic detergent로 lipid breakdown의 능력이 약하기 때문에 lipid membrane과 interaction하는 단백질들이 원심분리 후 침전물에서 나타나는 경우가 많습니다. 그러므로 SDS를 포함하는 lysis buffer를 사용하는 경우에 pellet의 크기가 확 줄어드는 것은 흔히 관찰할 수 있는 일입니다. 이런 경우 supernatant fraction에서 단백질이 관찰되는 경우가 종종 있죠... 단백질에 따라 freezing-thawing에 민감하게 변성을 일으키는 경우도 있습니다. 그럴 경우 insoluble aggregate가 형성되기도 합니다. 또한 cold-precipitation이 되는 단백질들도 많이 존재합니다. 이는 세포배양에 사용하는 혈청을 냉장고에 놔두면 침전물이 상당히 많이 생기는데서 관찰할 수 있습니다. 용해도는 물리화학적 특징이기 때문에 일차 및 삼차구조, pI 등의 단백질 자체의 요인과 pH, ionic strength, buffer component composisiton 등의 주변요인 등에의해 영향을 많이 받습니다. 일예로 hydrophobic interaction의 경우 ion 농도가 높을 수록 강하게 일어나죠...또한 salting out을 할 때도 침전되는 정도는 단백질마다 제각각으로 나타나죠. 이러한 것 뿐만 아니라 단백질이 침전될 수 있는 요인들은 굉장히 많이 나타납니다. cytoskeletal protein의 경우 dynamics를 고려하더라고 polymer 형태가 많이 존재하기 때문에 test tube에서 침전분획에서 관찰이 되는 경우가 많습니다. 문제는 해당 단백질이 세포내에서 lipid-soluble environment와 연관되기 때문에 test tube에서 insoluble fraction에서 관찰되는 것인지 아니면 biochemical experiment의 artifact로 인해 단백질의 physicochemical property에 영향을 주어 solubility의 변화를 초래하는 것인지를 잘 판단하셔야 될 것 같습니다. 그리고 특정조건에서 나타나는 물리화학적 특징으로 세포내의 위치를 판단하는 것은 조금 조심스러울 수 있습니다. 일반적으로 test tube의 experiment condition은 세포내의 환경과는 차이가 많이 나니까요...Viscosity가 하나의 대표적인 예가 되겠죠.. -
답변
박인영님의 답변
2005-05-02- 0
Mild한 buffer에서 freezing thawing하였을 때 모든 cell이 깨지진 않는 것 같더군요. 결국 생각할 수 있는 것은 pellet을 걸었을 때는 실제로 protein양이 supernatant에 비해서 월등히 높다는 것입니다. 따라서 세포 내 위치를 결정하기에는 조금 이른감이 있지않나 생각됩니다. 세포 내 위치를 결정하기 위해서는 nuclei, cytoplasm, mitochodria 등만을 따로 fractination해서 IB를 하셔야될 것이에요.