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지식나눔

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면역침강(IP) 후에 2D 할려고 하는데요..

2005-05-07 org.kosen.entty.User@15f6cbca 표재훈(ahrehd78)
  • 2
cell lysate를 antibody-separose bead로 pull-down 한 후에 elute를 농축하여 co-IP 되는 molecules를 보기 위해 2D-image analysis를 하려고 합니다만, 아직 적당한 농축법을 찾지 못하고 있습니다. elution buffer는 glycine buffer (pH 2.5)를 썼고 elution 후에 tris buffer (pH 9.0)으로 nutralize해 줬습니다. - acetone 침전했더니 pellet이 insoluble해지고.. - freeze drying 했더니 IEF시 voltage가 안올라 가더군요 IP 후에 2D로 image 보는 실험 하시는 분들 조언 좀 부탁드립니다.
  • immuno precipitation
  • 2D electrophoresis
  • protein precipitation
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답변 2
  • 답변

    박인영님의 답변

    2005-05-09
    • 0
    >cell lysate를 antibody-separose bead로 pull-down 한 후에 >elute를 농축하여 co-IP 되는 molecules를 보기 위해 2D-image analysis를 하려고 합니다만, 아직 적당한 농축법을 찾지 못하고 있습니다. >elution buffer는 glycine buffer (pH 2.5)를 썼고 >elution 후에 tris buffer (pH 9.0)으로 nutralize해 줬습니다. > >- acetone 침전했더니 pellet이 insoluble해지고.. >- freeze drying 했더니 IEF시 voltage가 안올라 가더군요 > >IP 후에 2D로 image 보는 실험 하시는 분들 조언 좀 부탁드립니다. > Millipore나 Amicon 등에서 파는 Centricon을 사용하시면 간단히 농축시킬 수 있습니다. Membrane filter를 이용 centrifuge를 돌려서 filtration하는 방법입니다. Pore size에 따라 다양하게 하실 수 있습니다. 침전도 일어나지 않고요. 2D 후에는 MALDI-TOF로 확인하시면 되겠고요.. 도움이 되셨기를..
    답변수정
    >cell lysate를 antibody-separose bead로 pull-down 한 후에 >elute를 농축하여 co-IP 되는 molecules를 보기 위해 2D-image analysis를 하려고 합니다만, 아직 적당한 농축법을 찾지 못하고 있습니다. >elution buffer는 glycine buffer (pH 2.5)를 썼고 >elution 후에 tris buffer (pH 9.0)으로 nutralize해 줬습니다. > >- acetone 침전했더니 pellet이 insoluble해지고.. >- freeze drying 했더니 IEF시 voltage가 안올라 가더군요 > >IP 후에 2D로 image 보는 실험 하시는 분들 조언 좀 부탁드립니다. > Millipore나 Amicon 등에서 파는 Centricon을 사용하시면 간단히 농축시킬 수 있습니다. Membrane filter를 이용 centrifuge를 돌려서 filtration하는 방법입니다. Pore size에 따라 다양하게 하실 수 있습니다. 침전도 일어나지 않고요. 2D 후에는 MALDI-TOF로 확인하시면 되겠고요.. 도움이 되셨기를..
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  • 답변

    전주홍님의 답변

    2005-05-09
    • 0
    첫번째 의견은 antibody를 protein-A나 protein-G bead에 붙인 후, covalent cross-linking을 시키는 protocol 사용이 좋을 것 같습니다. 그렇지 않으면 antibody (H or L chain) spot이 너무 진하게 나오니까요... covalent cross-linking을 시켜도 완벽하게 antibody spot을 제거하지는 못하지만 만족할만큼 줄일 수 있습니다. Pierce에서 Seize-X kit를 팔고 있습니다. 두번째 의견은 pH elution말고 IEF에 사용하는 buffer로 바로 elution을 하심이 어떨런지요...Urea자체가 단백질 변성을 유도하면서 antibody와 noncovalent interaction으로 결합된 것을 다 끊어버리니 바로 elution이 될텐데요...IP complex로 functional assay를 할 것이 아니니 크게 문제 없을 듯 합니다. 개인적인 생각이었습니다. 좋은 결과 얻으시길 바랄께요... >cell lysate를 antibody-separose bead로 pull-down 한 후에 >elute를 농축하여 co-IP 되는 molecules를 보기 위해 2D-image analysis를 하려고 합니다만, 아직 적당한 농축법을 찾지 못하고 있습니다. >elution buffer는 glycine buffer (pH 2.5)를 썼고 >elution 후에 tris buffer (pH 9.0)으로 nutralize해 줬습니다. > >- acetone 침전했더니 pellet이 insoluble해지고.. >- freeze drying 했더니 IEF시 voltage가 안올라 가더군요 > >IP 후에 2D로 image 보는 실험 하시는 분들 조언 좀 부탁드립니다. >
    답변수정
    첫번째 의견은 antibody를 protein-A나 protein-G bead에 붙인 후, covalent cross-linking을 시키는 protocol 사용이 좋을 것 같습니다. 그렇지 않으면 antibody (H or L chain) spot이 너무 진하게 나오니까요... covalent cross-linking을 시켜도 완벽하게 antibody spot을 제거하지는 못하지만 만족할만큼 줄일 수 있습니다. Pierce에서 Seize-X kit를 팔고 있습니다. 두번째 의견은 pH elution말고 IEF에 사용하는 buffer로 바로 elution을 하심이 어떨런지요...Urea자체가 단백질 변성을 유도하면서 antibody와 noncovalent interaction으로 결합된 것을 다 끊어버리니 바로 elution이 될텐데요...IP complex로 functional assay를 할 것이 아니니 크게 문제 없을 듯 합니다. 개인적인 생각이었습니다. 좋은 결과 얻으시길 바랄께요... >cell lysate를 antibody-separose bead로 pull-down 한 후에 >elute를 농축하여 co-IP 되는 molecules를 보기 위해 2D-image analysis를 하려고 합니다만, 아직 적당한 농축법을 찾지 못하고 있습니다. >elution buffer는 glycine buffer (pH 2.5)를 썼고 >elution 후에 tris buffer (pH 9.0)으로 nutralize해 줬습니다. > >- acetone 침전했더니 pellet이 insoluble해지고.. >- freeze drying 했더니 IEF시 voltage가 안올라 가더군요 > >IP 후에 2D로 image 보는 실험 하시는 분들 조언 좀 부탁드립니다. >
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