2005-05-09
org.kosen.entty.User@614f2d7e
김하정(hjdogdo)
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affinity를 이용한 것인가요?
polymyxin gel을 packing하고 E. coli에서 분리한 recombinant proteindml elute를 통과시켜 ELUTE를 받으면 protein이 거의 회수 되지 않습니다.
혹시나 해서 0.1M NaCl을 통과시킨 elute에서는 다량의 protein이 검출되고(SDS-PAGE로 관찰)
NaDC, water로 regeneration 시킨 후의 beed에도 소량이 남아 검출되었습니다.
polymyxin B gel을 통과시킨 후 elution되지 않고 regeneration까지 끝낸 beed에 남아있다면 그 recombinant protein이 beed와 nonspecific하게 결합한 것으로 해석해도 될까요?
아님 완전하게 regeneration되지 못한 polymyxin B-LPS에 그 recombinant protein이 binding하고 있는 것일까요?
어느 것도 배제하기는 힘든 게 아닐까하는데...
또한 NaCl로 elution한 fraction에서 검출된 것은 LPS의 오염이 어느 정도 될까요?
비싼 Endotoxin detection kit로 LPS를 측정해보는 것 왜에는 방법이 없는지요?
- LPS
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답변 1
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답변
전주홍님의 답변
2005-05-09- 0
Endotoxin은 음전하를 띄고 있기 때문에 anion exchange를 사용하면 잘 흡착이 되지만 단백질도 음전하를 띄면 분리하기가 힘든 면이 있습니다. 그러므로 단백질의 pI 값을 만약 알고 있다면 적절히 buffer pH를 조절하여 분리할 수도 있습니다. 이것이 힘들다면 affinity 기법으로 분리를 할 수 있는데 endotoxin의 lipid A에 특이적으로 결합하는 항생제의 일종인polymyxin B를 이용할 수 있습니다. 그러므로 polymyxin B bead를 사용하면 endotoxin을 효과적으로 제거할 수 있습니다. 그러나 polymyxin B 제거법의 단점 중의 하나는 단백질들이 polymyxin B에 비특이적으로 결합하는 경우가 발생한다는 것입니다. 그럴 경우 NaCl 등의 salt를 적정량을 첨가하면 단백질의 비특이적 결합을 억제할 수는 있으나 endotoxin에 대한 결합력도 같이 감소하기 때문에 endotoxin 제거가 제대로 안될 경우도 있습니다. 또한 elution fraction에 polymyxin B이 조금씩 contamination 될 수도 있으니 이점도 유의하셔야 됩니다. 아마 Kit 들이 LAL (Limulus Amebocyte Lysate) 테스트법을 기반으로 하고 있을 텐데 비싸지만 간편하게 사용할 수 있죠...