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우선 흔히 있는 일입니다. 일반적으로 회사에서 제공하는 library의 diversity는 백만 정도입니다. 이를 모두 screen할려면 diversity의 2-10 배 이상의 colony를 screening은 해야 됩니다. 그러므로 yeast transformation efficiency가 매우 좋아야 최대한 많은 library를 screening할 수 있습니다. 그런데 여기서 한가지 문제점은 yeast cell의 수와 DNA의 양과의 관계입니다. Yeast는 bacteria와 달리(Rep. Ori. 에 따른 plasmid incompatibility) 하나의 세포내에 여러개의 library plasmid를 존재할 수가 있습니다. Yeast 세포수는 작은데 DNA를 과량 사용하면 흔히 나타납니다. 제 경험으로도 하나의 yeast에 4개 이상의 각기 다른 plasmid가 존재했던 적도 종종 있었습니다. 문제는 다음과 같은 방법으로 해결할 수 있습니다. 1. Yeast에서 DNA를 추출 2. Bacteria에 transformation 3. 한 plate 당 10개 이상의 colony를 이용한 colony-PCR 4. PCR band의 size를 확인 5. Size가 다른 plasmid 각각을 bait가 들어있는 yeast에 re-transformation (이 과정을 통해 bait와 library가 1:1 reaction을 하는 겁니다) 6. Growth & Color selection 7. True positive 확인 8. DNA sequencing step이 좀 많지만 primary screening 후 re-transformation 과정을 거치는 것은 꼭 필요한 과정입니다. 만약 library가 한 종류만 있다고 해도 yeast two-hybrid는 in vivo interaction 확인 방법이고 growth와 color selection은 yeast의 mutation, 성장환경 등에 의해 민감하게 반응하기 때문에 반드시 필요합니다. 또한 filter lift assay와 liquid culture assay에서 지속적으로 positive로 나오는 clone을 고르는 것도 false-positive를 줄이는 방법입니다. re-transformation 후에는 위에서 언급했듯이 1:1 반응이기 때문에 모든 yeast colony가 positive로 나와야 결과를 신뢰할 수 있습니다. 다른 주의할 점은 1) 드물지만 gal4 DNA binding domain과 직접 library가 interaction 할 수도 있습니다. fusion이 안된 gal4 DNA binding domain과 libary의 interaction을 통해 확인할 수 있습니다. 아니면 domain swap 방법을 사용하는 분들도 있습니다. 2) AH109와 같은 strain은 selection marker 들의 promoter를 각각 다른 종류를 사용하기 때문에 드물게 일어나지만 HF7c와 같은 이전 세대의 host의 경우는 libary가 직접 DNA에 결합하여 positive로 나오는 경우가 흔히 있었습니다. 그러므로 re-transformation을 할 때에는 SFY526과 같은 다른 yeast strain을 사용하는 것이 false-positive를 줄이는 하나의 방법입니다. 답변이 충분했는지 모르겠네요... 좋은 결과 있으시길 바랍니다. >제가 cDNA library 에서 yeast two hybrid 을 이용하여 원하는 애들을 얻었습니다.. >그런후, 너무 많은 애들을 선별하기 위해, X-gal plate에서 한번 선별후, yeast plamid를 뽑았습니다.. >그런 다음, 그 DNA를 E.coli 에 선별 배지에서 트랜스포메이션한 뒤. E.coli의 plasmid를 뽑았습니다.. > >그런 다음, sequencing을 했는데..... >문제가 발생하였습니다.. >결과 하나의 plasmid 가 아닌것 같습니다.... 5개의 plasmid 가 모두 이런데.. >왜 이런것인지?? 이럴때, 어떻게 해야 하는건가요??