KOSEN 한인과학기술자네트워크

님의 글에 따르면, 관심의 단백질이 특정 세포주에서 과발현 된다고 하셨는데... 왜 특정 세포주인거죠?? 이 단백질이 암의 전이와 관련한 마커가 될 수 있다는 가정을 하고 계시다면 전이성을 가진 세포주에서 가능하면 모든 세포주에서 과발현되어 있는 것을 증명하는 것이 좋을 것 같은데요. 꺼꾸로 몇몇 세포주에서 과발현 된다면 그 단백질이 전이와 관련할 것이라는 전제(?)는 재검토의 대상이 되리라 생각됩니다. 또 한가지는 웨스턴에서 확인을 하셨다지만, 웨스턴에서 보이는 밴드가 꼭 그 단백질이라고만 믿지는 않으시는 것이 좋습니다. 왜냐하면, 저의 경험상 웨스턴은 싸이즈가 같다 하더라도 정확히 일치하는 싸이즈는 아니며 대충~ 의 조건하에서 싸이즈를 확인하고 있다는 것을 항상 감안하셔야 합니다. 한가지 고려해보실수 있는 실험은, 세포가 멤브레인을 통과하는 능력(전이능)에 관한 실험을 할 수 있습니다. 셀루로스멤브레인 위에다 세포를 놓고 배양을 하여 정해진 시간이 지난 후, 전이성이 있는 셀은 멤브레인을 통과해서 아래로 나오게 되는 원리입니다. 시중에서 키트를 팔고 있는데... 요즘 제가 실험을 안해서... 키트 이름이... 생각이 나질 않네요. 한가지만 더 첨언하자면, 비보 실험을 할 수 있다면 그것이 제일 좋습니다. 이경우 혈관으로 세포를 넣지 마시고 기관으로 넣어, 다른 기관으로 전이되는지를 확인한다면 제일 완벽한 실험이 되리라 생각됩니다. >최근에 제가 연구하고 있는 protein이 특정 cancer cell line 에서 과발현된다는 사실을, western과 2D에 의해서 확인하였습니다.이것을 주제로 paper를 준비하려고 하는데, 내용을 어떻게 만들어야 할지..아직 학위과정중이라 다른분의 조언을 바랍니다. >2D에서 spot을 identification할 생각은 아니고, 이미 animal model에서 metastasis를blocking한다(그 protein을 저해하는 comp를 가지고 있음)는 결과를 가지고 있습니다. >In vivo실험까지 범위를 잡으면 너무 방대해질것 같고 해서, 범위를 2D까지로 생각하고 있습니다.References를 보고 있는데, 어떤 방향으로 이끌어 가면 좋을지 조언해 주십시요

답변주셔서..감사합니다. 일단 cell line 을 밝히지 않으려고 합니다. 세포주는 invasion assay를 통해서 전이성을 확인하였고, 동물실험에서도 전이성이 확인되었습니다. 그리고 그 단백질이 어떤건지 알고 있습니다. 또한 western에서도 수없이 많이 확인했고, marker를 바꾸어 가면서도 확인하였습니다. 또한 여러 Antibidy로 C-term, N-term으로도 다 확인했습니다. 그러면 이 다음은 어떤걸 봐야 하지요?

단백질을 알고 계신다면 발현량을 확인하시는 것이 좋습니다. 어레이를 하게 된다면 유전자 페밀리가 있을 경우 같이 검토할 수 있겠고, 노던으로 하신다고 하여도 별 무리는 없을 것 같습니다만... 요즘 대세가 칩으로 하고 있으니... 어레이를 하시는 것이 좋겠지요. 그 다음으론 RNAi를 써서 그 세포주에서 그 유전자를 넉다운 시킨후 전이능을 같은 방법으로 확인하세요(이 경우 전이능을 상실하는 결과가 나와야 하겠죠!). 이것까지 마치시어 일관성 있는 결과를 도출하신다면 좋은 논문을 쓰실 수 있으리라 생각됩니다. 더이상 디스커션을 원하신다면 님의 전화번호를 메일을 통해서 알려주시는 것이 좋을 것 같습니다. 감사합니다. >최근에 제가 연구하고 있는 protein이 특정 cancer cell line 에서 과발현된다는 사실을, western과 2D에 의해서 확인하였습니다.이것을 주제로 paper를 준비하려고 하는데, 내용을 어떻게 만들어야 할지..아직 학위과정중이라 다른분의 조언을 바랍니다. >2D에서 spot을 identification할 생각은 아니고, 이미 animal model에서 metastasis를blocking한다(그 protein을 저해하는 comp를 가지고 있음)는 결과를 가지고 있습니다. >In vivo실험까지 범위를 잡으면 너무 방대해질것 같고 해서, 범위를 2D까지로 생각하고 있습니다.References를 보고 있는데, 어떤 방향으로 이끌어 가면 좋을지 조언해 주십시요

질문을 정확하게 파악하지 못한 관계로 임위로 답변을 드립니다. 일단은 질문상에서 특정 단백질의 과발현과 전이를 억제하는 현상이 correlation 관계는 확인하셨는데 cause-result 관계를 정립하셨는지 궁금합니다. 또한 일반적으로 실험실에서 이루어지는 functional study는 결국 drug development 과정에서 target identification/validation으로 귀결됩니다. 유용한 target을 발굴하여 검증을 하면 새로운 신약개발 전략을 제공할 수 있고 많은 환자에게 혜택이 돌아갈 확률이 높아지기 때문에 좋은 논문으로 인정받을 수 있는 겁니다. 사실 암의 경우 사람에서 cause-result relationship을 연구하는 것은 너무 힘들기 때문에 clinical specimen에서 correlation 관계가 확인되면 Experimental model에서 cause-result relationship을 확인하여 사람한테서도 유사하지 않을까라고 추정하게 됩니다. 다음 과정은 임상적 측면과 기초 생물학적 측면으로 넓혀 나갈 수 있습니다. 임상 연구는 샘플을 구하는게 쉽지 않고 임상연구의 기본개념을 익히는 것이 쉽지 않기 때문에 일단 기초생물학적 측면을 고려하면 다음과 같습니다. Experimental model에서 cause-result relationship은 크게 두가지 방법인데 하나는 gain-of-function이고 다른 하나는 loss-of-function의 접근법입니다. 두 가지 접근법에서 동일한 결론을 얻어내면 새롭게 밝힌 유전자의 기능에 대해 강력하게 주장할 수 있겠죠... 이러한 접근법으로 유전자 혹은 단백질과 현상과의 관계가 정립이 됩니다. 그렇다면 다음 문제는 mechanism of action이 됩니다. 어떠한 작용 기전으로 그러한 현상을 이끌어 내는지가 되는데 결국 유전자-현상의 관계를 어떻게 설명할까라는 문제입니다. 그러면 최종적으로 1. 전이가 잘 일어나지 않은 암세포주에서 특정 단백질이 과발현된다. 2. 특정 단백질의 발현이나 활성이 증가되면 암세포주의 전이능이 감소된다. 3. 특정 단백질의 발현이나 활성이 감소하면 암세포주의 전이능이 증가된다. 4. 특정 단백질은 이러이러한 기전으로 전이능을 조절한다. 5. 그러므로 이러한 발견의 중요성은 특정 단백질과 관계된 경로의 활성을 조절하는 신약을 개발하면 암세포의 전이를 억제할 수 있을 것이다. 조금 뜬 구름 잡듯이 얘기 한것 같은데 조금 더 많은 토의가 이루어 지면 손에 잡히는 방향이 나오겠죠...^^ 하시는 일 잘되시길 바랍니다. >최근에 제가 연구하고 있는 protein이 특정 cancer cell line 에서 과발현된다는 사실을, western과 2D에 의해서 확인하였습니다.이것을 주제로 paper를 준비하려고 하는데, 내용을 어떻게 만들어야 할지..아직 학위과정중이라 다른분의 조언을 바랍니다. >2D에서 spot을 identification할 생각은 아니고, 이미 animal model에서 metastasis를blocking한다(그 protein을 저해하는 comp를 가지고 있음)는 결과를 가지고 있습니다. >In vivo실험까지 범위를 잡으면 너무 방대해질것 같고 해서, 범위를 2D까지로 생각하고 있습니다.References를 보고 있는데, 어떤 방향으로 이끌어 가면 좋을지 조언해 주십시요

답변 감사합니다. mRNA의 level이 높다고 해서 꼭 그 protein의 level이 증가한다고는 볼수 없다는게 제 생각인데요, 단순히 RT-PCR로 확인해도 되지 않을까요? 그래도 꼭 어레이를 해야합니까? 또한 RNAinterference실험은 endogenous mRNA level을 확인함으로써 앞의 실험인 어레이 결과를 다시 확인하는 동시에, 그 protein이 기능을 못할경우(low level xxprotein mRNA) meta-는 일어나지 않는다. 라고 생각하면 되는 거지요? 제 e-mail 주소 입니다 : whencellslive@hotmail.com 실례가 되지 않으면 이 주소로 답변주시면, 고맙겠습니다.

어레이를 해야하느냐에 대하여선 본인이 선택하셔야 합니다. RT-PCR로 발현량을 확인하는 방법은 썩 좋은 생각은 아니라 생각됩니다. 저의 개인적인 느낌입니다만, 정량적 PCR을 했다는 것으로 그 발현량을 구릅간에 비교한다는 것은 그리 쉽지 않으며, 항상 크레임이 붙어 다닐 수 있습니다. 어느방향으로 실험을 진행할까, 내 연구가 더이상 무엇을 해야 할지 모를때에는 학회 등에서 다른분들은 어찌 하시나 하는 것을 유심히 살펴보는 것도 좋은 방법입니다. 암 전이와 관련해서는 전남대 의대의 한 구룹이 좋은 성과를 올리는 것으로 알고 있습니다. 선생님의 글을 읽으며 느끼는 바가 있는데... 하나의 확실한 증거가 있다고 해도, 그 증거만으로 어떤 결론을 내리는 것에 대하여 신중하심이 좋겠다는 느낌입니다. 잘 아시겠지만, 저희가 알고 있는 생물학은 전체 생물학에서 보면 일부에 지나지 않을테니까요.. 따라서 발현량을 확인하시고자 한다면, 두가지 실험 이상을 하시고 다음 스텝을 하시길 조언드립니다. 지면으로 디스커션 하기가 쉽지 않네요. 커피를 한잔마시며 두어시간 말씀을 나누어도 쉽게 도출되지 않을 방향에 대해서 글을 쓰고 있으니까요... 필요하시면 메일 주십시요. 대전이신것 같은데... 님께 도움이 될 수 있는 것을 제가 할 수 있다면 저도 기쁠테니까요... 암유전학에 있어서 연구의 큰 테두리는 다른분이 좋은 글을 주셔서 감사합니다. 머리속에만 있던 것이 었는데 명확히 글로 정리해 주셔서 저에게도 도움이 되었습니다. 그럼... 수고하세요.