2005-07-10
org.kosen.entty.User@64ebc944
정찬영(assaview)
- 4
갑자기 혼란스워서 급하게질문좀 드립니다.
blocking buffer을 만들시에 tbs-t에 skim milk를 녹이는지 tbs에 녹이는지가 혼란스럽네요..
좀 급하게 질문드립니다.
그리고 ab를 희석할때 tbs-t인지 tbs인지좀 가르쳐 주실레여..
어떤분은 blocking buffer에 ab를 희석하던데 이렇게 하는 이유는머죠.^^
기초적이지만 부탁좀 드리겠습니다..
- western blot
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답변 4
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답변
옥민호님의 답변
2005-07-11- 0
blocking buffer는 아무것도 아닌거 같아도, 경험상 매우 중요합니다. 어떤 membrane을 사용했는지도 중요하구요. 저는 통상 blocking buffer는 3% BSA, TBST를 사용합니다. 정제된 milk를 사용해도 되구요, 혹은 casein을 사용하기도 합니다. 이상하게도, TBST-milk를 사용했을때 시그널이 나오지 않다가도, 똑같은 조건에서 BSA를 사용하면 시그널이 깨끗하게 나오기도 합니다. 가장 좋은건, Ab를 주문하셨을때, 따라오는 protocol등을 참조하시고, 그대로 진행하면 대부분은 깨끗한 시그널을 얻을 수 있습니다. 또한 Ab incubation 시에도 마찬가지 현상이 발생합니다. 따라서 구입하신 Ab의 특성에 맞게, recommendation을 따라 가시는게 제일 좋을 듯 합니다. 저는 phospho Ab일 경우 주로 BSA로 blocking buffer를 만들고, Ab incubation 또한 blocking buffer로 해 줍니다. 그외 Ab일 경우 정제된 casein (I-Block)을 씁니다. 이 경우 microwave로 녹여서 사용하면 깨끗한 시그널을 얻을 수 있습니다. 참고 되셨으면 합니다. >갑자기 혼란스워서 급하게질문좀 드립니다. >blocking buffer을 만들시에 tbs-t에 skim milk를 녹이는지 tbs에 녹이는지가 혼란스럽네요.. >좀 급하게 질문드립니다. >그리고 ab를 희석할때 tbs-t인지 tbs인지좀 가르쳐 주실레여.. >어떤분은 blocking buffer에 ab를 희석하던데 이렇게 하는 이유는머죠.^^ >기초적이지만 부탁좀 드리겠습니다.. -
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김정민님의 답변
2005-07-11- 0
모두 TBST에 희석하여 사용하며, antibody를 blocking soln.에 희석하여 사용할수도 있으나 이경우는 시그날이 매우 강할때 입니다. 따라서 처음실험하는 antibody이면 이 역시 TBST에 희석하여 사용하세요. >갑자기 혼란스워서 급하게질문좀 드립니다. >blocking buffer을 만들시에 tbs-t에 skim milk를 녹이는지 tbs에 녹이는지가 혼란스럽네요.. >좀 급하게 질문드립니다. >그리고 ab를 희석할때 tbs-t인지 tbs인지좀 가르쳐 주실레여.. >어떤분은 blocking buffer에 ab를 희석하던데 이렇게 하는 이유는머죠.^^ >기초적이지만 부탁좀 드리겠습니다.. -
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전주홍님의 답변
2005-07-11- 0
위에서 좋은 의견을 많이 내주셔서 저는 몇가지만 첨부하면, Blocking은 비워있는 Membrane 공간에 단백질을 붙이는 작업인데, 이때 detergent가 존재하면, 사실 상당한 방해를 받는 건 사실입니다. 그러나 워낙 고농도의 단백질을 사용하기 때문에 경험적으로 mild detergent가 첨가되더라도 큰 문제점이 노출이 안되고 있습니다. 또한 tween 20 같은 detergent를 넣으면 tranfer 된 단백질이 조금씩 떨어져 나오는 것으로 알려져 있습니다. 그리고 small cationic protein의 경우 다른 단백질들 보다 훨씬 더 잘 떨어져 나옵니다. 이는 1980년대 analytical biochemistry에 여러편이 발표되었고, 저도 개인적으로 이와 같은 내용의 논문을 발표한 경험이 있습니다. 주로 문제점은 baking이나 glutaldehyde fixing 같은 방법을 사용하기도 하죠... 두번째로, antigen-antibody reaction은 결국 단백질-단백질 상호작용에 기초를 합니다. 그렇기 때문에 false-positive signal이 생길 수 있는 가능성은 항상 존재합니다. 그러나 이러한 상호작용은 결국 Kd의 지배를 받기 때문에 Kd에 영향을 줄 수 있는 요인들을 첨가하면서 false-positive를 줄이는 것입니다. 그러한 한가지가 detergent의 사용이 되겠죠... 또한 antibody의 Fc portion이나 cellular protein 중 sticky protein 들은 비특이적 결합이 잘 나타나기 때문에 고농도의 bsa 같은 걸 첨가하면 antibody와의 비특이적 결합이 억제되면서 bsa가 대신 결합하겠죠... 세번째는 위에서 언급했듯이 blocking을 어떤 단백질로 할 것인가인데 대부분의 경우 경험에 의존합니다. 다만 antibody에 따라서 calcium과 같은 divalent ion이 있으면 inactive해 지는 종류도 있으니 이럴 때는 milk (칼슘이 고농도로 존재) 를 dialysis를 시키든지 BSA나 Casein의 calcium content를 확인하면서 사용하시는게 좋겠죠... 좋은 결과 있으시길 바랍니다. >갑자기 혼란스워서 급하게질문좀 드립니다. >blocking buffer을 만들시에 tbs-t에 skim milk를 녹이는지 tbs에 녹이는지가 혼란스럽네요.. >좀 급하게 질문드립니다. >그리고 ab를 희석할때 tbs-t인지 tbs인지좀 가르쳐 주실레여.. >어떤분은 blocking buffer에 ab를 희석하던데 이렇게 하는 이유는머죠.^^ >기초적이지만 부탁좀 드리겠습니다.. -
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김현주님의 답변
2005-07-11- 0
+blocking buffer을 만들시에 tbs-t에 skim milk를 녹이는지 tbs에 녹이는지가 혼란스럽네요.. -TBST의 T는 Tween20입니다. 이것은 rinse의 역할을 담당합니다. 예전엔 skim milk를 TBS에 녹인 후에 따로 Tween20을 넣어서 (< 0.1%)사용했는데 어차피 TBS만 사용할 일이 없으므로 아예 Tween20을 넣어 TBST상태로 만든 후 Blocking buffer나 Washing buffer로 사용합니다. +어떤분은 blocking buffer에 ab를 희석하던데 이렇게 하는 이유는머죠 -antibody의 발현이 큰 경우에 buffer의 농도를 진하게 해서 사용하기도 하죠...대부분 blocking buffer는 3% skim milk in TBST 를 사용하고, Dilution buffer로는 1% skim milk in TBST 를 사용하는데 antibody에 따라서 Dilution buffer의 농도를 바꿔주기도 합니다.