2005-07-12
org.kosen.entty.User@22f53471
안수연(suli97)
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endothelia cell, smooth muscle cell culture 고수님들 제발 도와주세요!!
저희 lab에서는 aorta tissue를 이용하여 endothelia cell, smooth muscle cell culture를
진행하고 있습니다.
실험과정에서 contamination을 최소화 하기위해 나름대로 매우 철저하게 실험을 진행하고 있음에도 불구하고
계속 되는 contamination때문에 골머리를 앓고 있습니다.
'isolation of smooth muscle cells from a single murine aorta' methods in cell science 23: 185-188(2002)
를 참고하여 DMEM with 10% FBS에 1% penicillin/streptomycin,1% glutamine media와
fungizone을 사용하고 있습니다.
논문과 한가지 다르게 실험하고 있는것은 collagenase type2를 사용해야 하는데 저희는 crude를 사용하고 있습니다.
제품이 재고가 없어서 당분간만 사용할 예정입니다.
도대체 뭐가 문제이길래 계속 contamination이 되는 걸까요??
그리고 또 한가지 문제가 있습니다.
cell down이 되지 않아서 인지 tissue로 부터 cell을 얻을수 없었습니다.
어떻게 하면 될까요???
제가 생각못한 방법이 있다면 좀 알려주세요...
제발 좀 도와주세요!!!
- smooth muscle cell culture
- endothelia cell
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답변 2
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답변
안수연님의 답변
2005-07-13- 0
친절한 답변감사합니다. 지적해 주신 내용을 다시 번 검토해 봐야겠습니다. 메디아와 다른것들은 크게 문제가 될꺼 같지 않습니다만( 같은 메디아로 다른 셀들은 contam없이 잘 자라고 있거든요...) 현재 의심하고 있는것은 isolation할때 너무 오픈되어있는 공간이 문제가 아닐까 합니다.. 말씀 하신 poly-L-lysin corting한 well에 seeding해 보았지만 차이가 없었습니다...ㅠ.ㅠ 다시 한번 차근차근 돌아봐야할꺼 같습니다. 많은 도움 주셔서 감사합니다.^^ -
답변
허경선님의 답변
2005-07-13- 0
안녕하세요. 저는 현재 primary smooth muscle cell을 clonetics에서 구입하여 사용하고 있는데요.. 단지 contamination이 문제라면 도움이 될것 같아서요.. endotherial cell과 smooth muscle cell을 primary culture시엔 antibiotic중 amphotericin B를 추가해주는것이 좋습니다. Cambrex사의 GA-1000 (대전 영사이언스) 또는 Cascade biologics사의 PSA solution (서울 이노메디텍)이 muscle cell culture antibiotics이니 참고 하시기 바랍니다. 그리고 혹시 rat의 tissue로부터 primary cell culture중이시라면 일반적으로 15% DMEM media를 사용하는 것으로 알고있습니다. growth factor와 hormone을 대신해서 FBS를 높여준것이지요. Nutrient media인 DMEM/F-12K media를 사용하는것도 괜찮을 듯 합니다. Endothelial cell의 경우 media조성이 또 다릅니다. 위의 회사 홈페이지에 들어가시면 media들이 나와있으니 참고하시길... 또한, cell down이 문제가 된것 같다하셨는데, 혹시 matrix를 깔아 주셨나요? Dish에 gellatin이나 poly-L-lycine을 전처리 하셨다면 cell down은 문제 없을것 같은데요... 마지막으로 contamination의 원인을 제거해야 할 듯한데요... 크게는 media, cell culture room, handling을 생각할 수 있는데요.. media속의 serum은 자칫하면 contamination이 잘 될수 있으니... dish에 사용하셨던 media를 분주한 후 2-3일 정도 incubation하시면 알 수 있습니다. 그리고 때론 습한 waterbath가 문제가 될 수 있습니다. waterbath의 물은 3차증류수가 좋구요.... 지저분하지 않는지 check하는게 좋을듯한데요..또한 waterbath에서 데워진 media등등 bottle은 반드시 ethanol washing해서 clean bench로 들어가야합니다. 그것도 아니라면 cell isolation시 handling과정에서 contamination이 생길 수 있을것 같은데요.... 과정을 check해보는게 어떨까요... 행운을 빕니다.