2005-08-22
org.kosen.entty.User@2efff4b8
이현정(endeavor821)
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안녕하세요~
다름이 아니오라 궁금한게 있어 이렇게 글을 올립니다.
제가 GST-fusion protein으로 GST pull down assay를 하려고 하는데 assay하기 전에 fusion protein을 dialysis 하려고 합니다.
이때 dialysis buffer 조성이 어떻게 되나요?
dialysis buffer 조성은 protein을 어디에 사용할지에 따라 다르게 쓴다고 하던데,, 잘 모르겠어요.
현재 실험진행 상태를 말씀 드리자면 Protein expression 하여 GST resin에 binding 후 GST elution buffer로 protein elution까지 한 상태이거든요. Protein elution step까지 사용한 buffer가 PBS니깐 PBS로 dialysis하면 된다고 하는데 정확하게 알고 싶어요.
제가 찾은 정보에 의하면 dialysis buffer 조성이 아래와 같습니다.
Dialysis Buffer
Metal and Salt Ions (NaCl, KCl, MgCl2, etc.)
Other small molecules (Glycerol, DTT, ATP, etc.)
Typical Protein Buffering Agent (Tris, HEPES, Phosphate-based, etc.)
저도 나름대로 더 찾아보겠지만 님들의 답변을 듣고 싶어요~
그럼 빠른 답변 기다리겠습니다.
- protein dialysis
- GST-pull down assay
- GST fusion protein
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
전주홍님의 답변
2005-08-22- 0
Dialysis buffer 조성이 딱히 정해진 것은 없습니다. Dialysis의 목적이 salt의 제거나 buffer의 교환 등이기 때문에 Pull down assay에 적합한 buffer를 선택하시면 별 무리는 없습니다. elution이 끝난 후이기 때문에 free glutathion을 잘 제거해야 다음 pull down assay시 yield를 높일 수 있겠죠... 다만 특정 component가 protein의 stability나 activity가 영향을 줄 수 있기 때문에 이를 조심하셔야 겠지요... Pull down assay의 condition이 Tris-based buffer라면 Tris-based buffer로 투석을 하는 것이 괜찮겠지요...꼭 그렇지 않더라도 단백질의 농도가 높다면 pull down assay시 미량의 volume을 사용하게 되므로 단백질의 활성에 중점에 두어 buffer를 사용하는 것이 좋을 것 같은데요... >안녕하세요~ >다름이 아니오라 궁금한게 있어 이렇게 글을 올립니다. > >제가 GST-fusion protein으로 GST pull down assay를 하려고 하는데 assay하기 전에 fusion protein을 dialysis 하려고 합니다. >이때 dialysis buffer 조성이 어떻게 되나요? >dialysis buffer 조성은 protein을 어디에 사용할지에 따라 다르게 쓴다고 하던데,, 잘 모르겠어요. > >현재 실험진행 상태를 말씀 드리자면 Protein expression 하여 GST resin에 binding 후 GST elution buffer로 protein elution까지 한 상태이거든요. Protein elution step까지 사용한 buffer가 PBS니깐 PBS로 dialysis하면 된다고 하는데 정확하게 알고 싶어요. >제가 찾은 정보에 의하면 dialysis buffer 조성이 아래와 같습니다. > >Dialysis Buffer > >Metal and Salt Ions (NaCl, KCl, MgCl2, etc.) >Other small molecules (Glycerol, DTT, ATP, etc.) >Typical Protein Buffering Agent (Tris, HEPES, Phosphate-based, etc.) > >저도 나름대로 더 찾아보겠지만 님들의 답변을 듣고 싶어요~ >그럼 빠른 답변 기다리겠습니다. > > > -
답변
박인영님의 답변
2005-10-25- 0
Dialysis도 두어번 하시면 깨끗해서 좋겠죠. 먼저 PBS 같은 buffer로 대량으로 하시고 마지막에 Pull down 하실 때 쓸 buffer로 적은 양으로 하시면 되겠습니다. Pull down 시 RIPA buffer를 쓰실 것이라면 이 buffer에 proteinase inhibitor를 첨가하셔서 dialysis를 하세요. Binding을 PBS + protease inhibitor로 하실 것이면 PBS로만 하셔도 되겠네요..