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전후 상황을 잘 모르겠지만 protein interacting complex를 분리해서 complex를 구성하는 subunit가 어떤 단백질인지를 확인하기 위해 사용하는 방법으로 보입니다. 간단히 설명하면 Protein의 총합을 Proteome이라고 하듯이 interaction의 총합을 interactome이라고 부릅니다. Interactome을 구성하는 단백질 복합체 및 개개의 단백질을 확인하는 방법은 크게 두가지로 나누어 생각해 볼 수 있습니다. 첫째는 reverse interactomics로 DNA를 기반으로 단백질의 상호작용을 알아내는 방법입니다. 대표적인 방법이 yeast two-hybrid screening입니다. 이는 단백질의 물리화학적 특성을 모르더라고 간편하게 수행할 수 있으면 특정 장비가 필요하지 않다는 장점이 있습니다. 반면 주로 binary interaction이 확인되기 때문에 protein complex를 구성하는 모든 subunit을 파악하기에는 무리가 있습니다. 두번째는 forward interactomics로 단백질을 기반으로 단백질의 상호작용을 알아내는 방법입니다. 대표적인 방법이 Co-immunoprecipitation/Mass spectrometry입니다. A라는 단백질에 대한 항체를 이용하여 면역침전을 유도하면 A와 상호작용을 하는 단백질들이 같이 침전이 되겠죠...그래서 Co-IP라는 말을 사용합니다. 물론 A와 직접적으로 상호작용을 하지 않더라도 A가 포함된 단백질 복합체는 면역침전되기 때문에 complex를 구성하는 subunit를 확인하기에 좋은 방법입니다. 주로 Co-IP 후 전기영동 (1차 또는 2차)을 하고 밴드 또는 스폿을 elution해서 질량분석을 통해 단백질의 정체를 확인합니다. 물론 이 방법은 단백질 구성원간의 상호작용을 알 수가 없습니다. 또한 biochemical complex인지, biological complex인지를 잘 파악해야하는 단점도 있습니다. 그래서 이 두가지를 병행하는 방법도 많이 이용되고 있습니다. Co-IP/Mass analysis를 하면 complex의 모든 subunit를 확인할 수 있습니다. 그런 후 yeast two-hybrid system을 이용, 각각의 subunit에 대한 cDNA를 이용하여 1:1로 interaction여부를 판가름 할 수 있습니다. 저번에 two-hybrid에 대해서 질문하신 것 같은데 제가 첨부한 파일을 한번 읽어보시면 조금 더 많은 내용이 있을 겁니다. >Immunoprecipitation for MALDI mass spectrometry > >ip-mass라고도 하던데.. >어떤것인가요? 답변 부탁드립니다.

>Immunoprecipitation for MALDI mass spectrometry > >ip-mass라고도 하던데.. >어떤것인가요? 답변 부탁드립니다. MALDI-TOF MS(Matrix Assisted Laser Desorption Time of Flight Mass Spectrometer)는 분석하고자 하는 단백질은 peptide를 trypsin으로 잘라내어 잘려진 peptide의 고유한 질량을 분석하는 장치이다. 질량분석은 분석하고자 하는 단백질의 잘려진 peptide를 matrix라는 물질과 결합시킨 후 MS장치의 레이저 에너지를 통한 고유한 peptide의 질량이 비행하는 거리를 측정함으로 이루어지는데, 이렇게 얻어진 질량 값은 database와 일치시킴으로 고유한 단백질이 어떤 것인지를 동정하는 것이다. 현재 proteomics의 2-Dimensional Gel Electrophoresis를 통한 단백질 분리방법과 결합하여 빠르고 대량으로 원하는 단백질을 분석하고 동정하는데 사용되고 있다. 적은 양으로 분석이 가능하며 다른 Mass장치들에 비해서 시간이 적게 걸리며, 대량으로 분석할 수 있는 장점이 있다. 이상이 설명 나온 것이고.. 아래는 Immunoprecipitation for MALDI mass spectrometry Protocol입니다. Protocol: Immunoprecipitation for MALDI mass spectrometry Carolyn Livsey IP Buffer: (this is 1x but I usually make 10x stock) 0.1% Triton X-100 140 mM NaCl 0.025% Na Azide 10 mM Tris-HCl protease inhibitors (Calbiochem cocktail) (This protocol should be done in the cold room) Step 1: to get rid of non-specific Ig binding to beads add equal volumes of your sample and normal rabbit serum 1x IP buffer rotate overnight add beads (Calbiochem Protein G Plus / Protein A Agarose) rotate 3 hours centrifuge save supernatant, discard beads Step 2: immunoprecipitate add antibody to supernatant rotate overnight add beads rotate 3 hours centrifuge save beads, discard supernatant Step 3: wash beads add 500 µl IP buffer, rotate 10 minutes, centrifuge, discard supernatant repeat 2 times with IP buffer repeat 2 times with Tris HCL pH 8 (to get rid of protease inhibitors, salt, detergent) Step 4: elute elution buffer: TFA/H2O/acetonitrile 1 : 20 : 20 add 40 µl elution buffer to beads rotate 10 minutes centrifuge save supernatant, discard beads After elution, the sample can be analyzed by mass spectrometry to determine the molecular weight. I use Maldi-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight). To confirm a peptide sequence within a known protein, the peptide can be oxidized with 10µM H2O2. This oxidizes every methionine in the sample and shifts the molecular weight up by 16 for each methionine (R. Wang et al., 1996) Wang R; Sweeney D; Gandy SE; Sisodia SS. The profile of soluble amyloid beta protein in cultured cell media. Detection and quantification of amyloid beta protein and variants by immunoprecipitation-mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry, 1996 Dec 13, 271(50):31894-902