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seq.한두개가 빠지거나 추가되서 클로닝되면 원하지 않은 모양의 단백질이 된답니다. 대신에 nucleotide seq로 blast를 하면 빠지거나 추가된 것 빼고는 다 맞다고 나오겠지요.. 이렇게 생성된 단백질과 결합하는 단백질이라.. study하면 재밌겠지만 깊숙히 묻어두셔야할 것 같고요. 새로이 cloning을 하시길 권면해 드려봅니다... 힘내세요.. 그래도 한번 결과를 얻어보셨으니 금방 진척 이루실 겁니다... >실험결과에 대해 궁금한 점이 있어 이렇게 글을 올립니다. > >제가 cloning을 해서 protein expression을 하려고 합니다. > >그런데 protein expression이 안되더라구요. > >GST fusion protein을 만들었는데 GST만 expression되구.... > >그래서 혹시나 하는 마음에 sequencing을 맡겨봤더니 clone자체에 문제가 있었더라구요. > >nucleotide 하나가 빠져 있었습니다. > >문제는 이것 뿐이 아니라 더 걱정이 되네요.. > >Fusion protein을 만들고자 하기 이전에 그 해당 protein을 가지고 yeast > >three hybrid를 했는데 기존에 보고되어 있는 protein은 거의 나오질 않고 > >쌩뚱맞은 것들만 나왔는데 그게 전부 애초부터 clone이 잘못되어 나온 결과 일까요? > >DNA sequencing해서 얻은 결과로 blast search 해보니깐 > >제가 원하는 protein으로 나오긴 하던데,,,, 이건 어떻게 설명해야 되는 건가요? > >nucleotide가 하나 빠져서 frame이 안 맞더라구요... > >그럼 전혀 다른 protein이 만들어 지는거 아닌가요? > >그래서 잘못된 clone의 sequence를 가지고 translator를 돌려 아미노산 서열을 봤더 > >니 제가 원하는 protein과 전혀 다른 걸로 나왔는데.... > >단지 1개의 nucleotide 차이니깐 확률로 따져서 homology[mRNA상]가 있다고 나오는 걸까요? > >웅~~ 전 어떻게 해야하나요?? ㅠㅜ 지금 석사 4학기인데.. > >어쩜 좋아~~ ㅠㅜ 흑흑,,, > >빠른 답변 부탁드립니다.

원문사이에 조언을 드리죠. [원문] 실험결과에 대해 궁금한 점이 있어 이렇게 글을 올립니다. 제가 cloning을 해서 protein expression을 하려고 합니다. 그런데 protein expression이 안되더라구요. GST fusion protein을 만들었는데 GST만 expression되구.... 그래서 혹시나 하는 마음에 sequencing을 맡겨봤더니 clone자체에 문제가 있었더라구요. nucleotide 하나가 빠져 있었습니다. [조언] 일단 GST에 삽입한 insert를 어떻게 확보했느냐에 답이달라집니다. 1. 제한효소로 잘라서 얻었다면 원래 source가 잘못？榮彭？ligation시 exo먹어서 1 base날라간 case입니다. 2. source DNA에서 PCR로 빼겨서 insert를 사용했다면 -cloning에 사용한 PCR용 oligo design에서 빠졌으면 첨부터 다시cloning하셔야 합니다. 경험이 적은면 frame을 잘 맞추지 못하여 망하는데 sequencing결과 in-frame이 아니면 다시 cloning하셔야합니다. 다만 경험상 유전자에 중간부분에서 한 base 빠지는경우가 있습니다. 이경우는 반드시 그부위를 양방향으로 sequencing하셔야합니다. 간혹 한 base가 안보이는게 보이기도합니다. PCR시 1 base pair deletion mutation은 잘 안 일어나기 때문입니다. 하지만 질문자께서는 GST-fusion상에서도 GST만 나온다고 하니 후자의 확률도 없습니다. 다시 cloning하십시요. 이때 Taq polymerase는 국내회사인데 솔젠트라는 회사에서 나온 유사pfu 나 KOD 를 사용하시면 proof reading activity가 있어 좀더 좋습니다. [원문] 문제는 이것 뿐이 아니라 더 걱정이 되네요.. Fusion protein을 만들고자 하기 이전에 그 해당 protein을 가지고 yeast three hybrid를 했는데 기존에 보고되어 있는 protein은 거의 나오질 않고 쌩뚱맞은 것들만 나왔는데 그게 전부 애초부터 clone이 잘못되어 나온 결과 일까요? DNA sequencing해서 얻은 결과로 blast search 해보니깐... nucleotide 하나 빠진 sequence를 가지고서,,,제가 원하는 protein으로 나오긴 하던데,,,, 이건 어떻게 설명해야 되는 건가요? nucleotide가 하나 빠져서 frame이 안 맞더라구요... 그럼 전혀 다른 protein이 만들어 지는거 아닌가요? [조언] 전혀 다릅니다. 따라서 나온 data를 버려야합니다. [원문] 그래서 잘못된 clone의 sequence를 가지고 translator를 돌려 아미노산 서열을 봤더 니 제가 원하는 protein과 전혀 다른 걸로 나왔는데.... 단지 1개의 nucleotide 차이니깐 확률로 따져서 homology[mRNA상]가 있다고 나오는 걸까요? [조언] blast야 in-frame이든 outof-frame이든 상관없이 homology만 표시할뿐입니다.이미 frame을 벗어났으면 끝입니다. 다시 하셔야합니다. [원문] 웅~~ 전 어떻게 해야하나요?? ㅠㅜ 지금 석사 4학기인데.. 어쩜 좋아~~ ㅠㅜ 흑흑,,, 빠른 답변 부탁드립니다. [조언] 정 안되면 제게 멜 주세요. 전화로 상담해드릴테니...

Yeast three-hybrid를 하신는 걸 보니, RNA-interacting protein이나 bridging protein 혹은 특정 hybrid chemical compound와의 interaction 실험을 하시는 것 같습니다. 그리고 잡아낸 클론이 진짜인지를 in vitro binding assay로 확인하다가 잘못된 점이 확인이 된 것 같은데 바르게 이해했는지 모르겠습니다. 일단 Y3H의 bait construct에서는 염기서열의 이상 여부가 궁금하네요... 물론 insert를 확보해서 (PCR 등의 방법으로) 동시에 Y3H bait vector와 pGEX vector에 클로닝을 하였다면 정말 문제가 되겠지만 insert를 독립적으로 준비해서 각각의 vector에 클로닝했다면 Y3H vector의 insert는 정상일 수도 있겠지요... (물론 처음 template 자체가 문제가 있었다면 비상시국이 되겠지만요...). 그리고 library를 이용하여 yeast hybrid system을 해 보면 기존에 알려져 있는 단백질들이 안나오는 경우는 무지 흔한일입니다. Y2H의 경우 genome-wide screening을 한 결과들을 보면 (물론 결과가 많이 않아서 정확이 말할 순 없지만) 기존의 알려진 interaction의 10% 정도 밖에 찾지 못하는 경우가 많았습니다. 저 또한 같은 bait로 5회 이상을 시행하였는데도 한번도 중복된 clone이 없는 경우도 많았구요... 하나 하나 체크해서 어디서부터 잘못되었는지를 일단 찾아내시는 게 가장 급선무가 아닐까 생각합니다. 위기는 위험과 기회의 기로입니다. 힘내시길 바랍니다. >실험결과에 대해 궁금한 점이 있어 이렇게 글을 올립니다. > >제가 cloning을 해서 protein expression을 하려고 합니다. > >그런데 protein expression이 안되더라구요. > >GST fusion protein을 만들었는데 GST만 expression되구.... > >그래서 혹시나 하는 마음에 sequencing을 맡겨봤더니 clone자체에 문제가 있었더라구요. > >nucleotide 하나가 빠져 있었습니다. > >문제는 이것 뿐이 아니라 더 걱정이 되네요.. > >Fusion protein을 만들고자 하기 이전에 그 해당 protein을 가지고 yeast > >three hybrid를 했는데 기존에 보고되어 있는 protein은 거의 나오질 않고 > >쌩뚱맞은 것들만 나왔는데 그게 전부 애초부터 clone이 잘못되어 나온 결과 일까요? > >DNA sequencing해서 얻은 결과로 blast search 해보니깐 > >제가 원하는 protein으로 나오긴 하던데,,,, 이건 어떻게 설명해야 되는 건가요? > >nucleotide가 하나 빠져서 frame이 안 맞더라구요... > >그럼 전혀 다른 protein이 만들어 지는거 아닌가요? > >그래서 잘못된 clone의 sequence를 가지고 translator를 돌려 아미노산 서열을 봤더 > >니 제가 원하는 protein과 전혀 다른 걸로 나왔는데.... > >단지 1개의 nucleotide 차이니깐 확률로 따져서 homology[mRNA상]가 있다고 나오는 걸까요? > >웅~~ 전 어떻게 해야하나요?? ㅠㅜ 지금 석사 4학기인데.. > >어쩜 좋아~~ ㅠㅜ 흑흑,,, > >빠른 답변 부탁드립니다.

한가지만 알려드리겠습니다. Sequence 한 결과 nucleotide 하나가 빠져 있는것 만이 문제라면 그주위로 약 40 bp 의 primer를 만 드신 후 pfu polymerase로 PCR 해보십시요 (site direct mutagenesis 방법 응용). PCR 후 --> DpnI treat --> Transformation. colony를 키워 sequencing 해 보시면 원하시는 sequence를 얻을 수 있을 겁니다.