2005-09-13
org.kosen.entty.User@630d568e
이현정(endeavor821)
- 3
궁금한게 있어 이렇게 글을 올립니다.
다름이 아니라, sequencing을 맡겼는데 그 결과가 잘못 될 확률은 얼마나
될까요?
sequencing을 맡겼는데 nucleotide 하나가 빠져 있었습니다.
그게 sequencing을 분석함에 있어 착오로 인해 생긴 결과일 수도 있지 않나요?
중요한 샘플인지라....
다른 곳에도 sequencing을 맡겨 볼 생각입니다.
다른 곳에서의 결과도 마찬가지로 나온다면 제가 cloning을 잘못한 것이겠죠....
믿고 싶지 않은 사실이지만....
이렇게까지 생각한 이유는 잘못된 clone을 가지고 Yeast two hybrid system을 돌렸는데 나온 target들을 살펴보면 clone이 잘못된게 아니란 생각이 들거든요...
기존에 보고된 것과 똑같진 않지만 유사한 것도 있고....
sequencing 결과를 보면 아미노산 10개도 채 안 만들어지고 바로 stop codon이 존재하던데 그런 clone을 이용해 yeast system을 돌려서 제가 말하는 그런 target protein이 얻어졌을까? 하는 의문이 생깁니다.
애초에 잘못됐다면 처음부터 결과가 제대로 나오지 않아야 하는게 아닌가? 하는 생각이 드는데.... 제 생각이 틀린가요?
yeast가 variation이 심해 잘못된 clone을 사용했더라도 결과가 나온 것일까요???
궁금합니다.
빠른 답변 듣고 싶어요~~!!
- sequencing analysis
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 3
-
답변
전주홍님의 답변
2005-09-13- 0
GC-rich sequence 이거나 long-run이 있는 경우 착오가 생길 수도 있습니다... sequence만 확인하시지 말고 peak를 들여다 보면 이러한 점들은 발견할 수도 있구요...아니면 역방향으로 sequencing해서 확인해 보시는 방법도 있습니다. sequencing error도 있을 수 있으니 같은 클론을 적어도 두번 이상 sequencing하시는 것도 좋을 수 있습니다. 아미노산이 10개가 안되더라도 Y2H에서 클론들이 걸려나올 수 있습니다. 반대로 prey를 sequencing해 보면 어떤 경우엔 1-2개의 아미노산만 존재하는 경우도 있습니다 (물론 패턴은 bait에 따라 정말 다르게 나옵니다). 몇 개의 아미노산이 gal4 DNA binding domain이 붙더라도 DNA binding activity에는 큰 영향을 주지 않으면서 structural change를 유도할 수 있습니다. 이렇게 되면 electrostatic interaction이나 hydrophobic interaction에 참가하거나 H-bond를 제공하거나 받을 수 있는 아미노산의 공간적 배열이 달라지기 때문에 prey는 얼마든지 잡혀 나올 수 있습니다. 또한 peptide library를 특정 분석시스템에서 screening하여 원하는 peptide를 선별한 후, Gal4-DBD에 fusion하여 peptide의 target을 Y2H로 찾는 전략을 사용한 예들도 있습니다. 특히, cytoskeletal protein, ribosomal protein, proteosomal protein, heat shock protein 등은 false-positive가 될 가능성이 높은 단백질 이구요... -
답변
박인영님의 답변
2005-10-04- 0
>궁금한게 있어 이렇게 글을 올립니다. > >다름이 아니라, sequencing을 맡겼는데 그 결과가 잘못 될 확률은 얼마나 > >될까요? > >sequencing을 맡겼는데 nucleotide 하나가 빠져 있었습니다. > >그게 sequencing을 분석함에 있어 착오로 인해 생긴 결과일 수도 있지 않나요? > >중요한 샘플인지라.... > >다른 곳에도 sequencing을 맡겨 볼 생각입니다. > >다른 곳에서의 결과도 마찬가지로 나온다면 제가 cloning을 잘못한 것이겠죠.... > >믿고 싶지 않은 사실이지만.... > >이렇게까지 생각한 이유는 잘못된 clone을 가지고 Yeast two hybrid system을 돌렸는데 나온 target들을 살펴보면 clone이 잘못된게 아니란 생각이 들거든요... > >기존에 보고된 것과 똑같진 않지만 유사한 것도 있고.... > >sequencing 결과를 보면 아미노산 10개도 채 안 만들어지고 바로 stop codon이 존재하던데 그런 clone을 이용해 yeast system을 돌려서 제가 말하는 그런 target protein이 얻어졌을까? 하는 의문이 생깁니다. > >애초에 잘못됐다면 처음부터 결과가 제대로 나오지 않아야 하는게 아닌가? 하는 생각이 드는데.... 제 생각이 틀린가요? > >yeast가 variation이 심해 잘못된 clone을 사용했더라도 결과가 나온 것일까요??? > >궁금합니다. > >빠른 답변 듣고 싶어요~~!! PCR로 cloning하셨다면 1kb 당 한 개 정도의 mutation이 일어나더군요..그래서 500 bp 이하로 하시면 안전하고요.. 나중에 붙이시는 게 더 빠를 수도 있습니다. insert 안에 짧은 repeat이 존재한다면 더더욱 안되고요.. 일단 sequencing을 양방향으로 하시고 양방향으로 하셨을 때 모두 그런다면 cloning을 다시 하셔야합니다. 그래도 의심스러우면 Western blot으로 protein size를 확인하세요..어차피 겪어야 되는 것이니까요.. -
답변
DELETED님의 답변
2010-01-09- 0
>궁금한게 있어 이렇게 글을 올립니다.>>다름이 아니라, sequencing을 맡겼는데 그 결과가 잘못 될 확률은 얼마나 >>될까요?>>sequencing을 맡겼는데 nucleotide 하나가 빠져 있었습니다.>>그게 sequencing을 분석함에 있어 착오로 인해 생긴 결과일 수도 있지 않나요?>>중요한 샘플인지라....>>다른 곳에도 sequencing을 맡겨 볼 생각입니다.>>다른 곳에서의 결과도 마찬가지로 나온다면 제가 cloning을 잘못한 것이겠죠....>>믿고 싶지 않은 사실이지만....>>이렇게까지 생각한 이유는 잘못된 clone을 가지고 Yeast two hybrid system을 돌렸는데 나온 target들을 살펴보면 clone이 잘못된게 아니란 생각이 들거든요...>>기존에 보고된 것과 똑같진 않지만 유사한 것도 있고....>>sequencing 결과를 보면 아미노산 10개도 채 안 만들어지고 바로 stop codon이 존재하던데 그런 clone을 이용해 yeast system을 돌려서 제가 말하는 그런 target protein이 얻어졌을까? 하는 의문이 생깁니다. >>애초에 잘못됐다면 처음부터 결과가 제대로 나오지 않아야 하는게 아닌가? 하는 생각이 드는데.... 제 생각이 틀린가요?>>yeast가 variation이 심해 잘못된 clone을 사용했더라도 결과가 나온 것일까요???>>궁금합니다.>>빠른 답변 듣고 싶어요~~!! >업체를 못 믿으시면, 다른 업체에 의뢰를 해보시는게 좋을듯 합니다. 그리고 가능하다면, enzyme digestion해보시는 것이 좋을 듯 하네요..