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일단 target gene의 염기서열을 알고 있는 것으로 이해했습니다. Yeast는 strain과 gene에 따라 intron이 없는 유전자도 많이 있습니다. 만약 intron이 없다면 genomic DNA로 부터 PCR로 cloning을 할 수 있습니다. intron이 있다면 RNA를 추출한 후 RT-PCR로 cloning을 할 수 있습니다. 만약 유전자의 크기가 매우 크다면 restriction map을 참고하면서 fragment로 PCR을 한 후 다시 짜맞추기 과정을 통해 full-length gene을 완성시킬 수 있습니다. 물론 high-fidelity PCR system을 써면 pcr error에 의한 유전자 변형을 줄일 수 있겠죠... PCR 한번에 원하는 cDNA를 증폭시킬 수 있다면, PCR primer에 적절한 restriction enzyme site를 집어 넣은 걸 사용하면 바로 prokaryotic expression vector로 cloning이 가능하겠죠...물론 이때에는 restriction enzyme 마다 recognition sequence 이외에 일반적으로 1-10 base 정도의 여부의 염기가 있어야만 digestion이 가능하니 이를 유의하셔야 할 것 같습니다. 물론 어떤 vector system을 사용하느냐가 매우 중요하겠고 이에 따라 host가 달라질 수 있으니 잘 선택을 하셔야 될 것 같습니다. 또한 vector에 따라 promoter를 다르게 사용하니 gene inducer가 다르게 사용되고 있으니 여러 상황을 고려해서 선택하셔야겠지요... 또 다른 한가지는 recombinant protein을 prokaryotic cell 안에서만 존재하는 system을 사용할 것인가 아니면 secretion을 유도할 것인가 등을 고려해서 vector-host system을 선택하셔야 할 것 같습니다. 이는 protein folding문제와도 많은 상관관계가 있기 때문에 중요한 문제가 될 것 같습니다. 일반적으로 prokaryote는 post-translational modification machinery가 진행생물과는 다르기 때문에 같은 cytosolic protein이라도 prokaryote의 세포질에서 발현시키면 inclusion body가 형성되는 경우가 많습니다. seretion되는 단백질이라면 대부분 disulfide bond를 가지므로 이를 경우에 prokaryote의 cytosol에 발현시킨다면 문제가 많이 발생할 수 있습니다. 또 다른 문제는 tagging 또는 fusion 시스템을 사용할 때 발생하는 것인데 in-frame에 대한 문제는 기본이고 만약 원하는 유전자가 zymogen일 경우 active form으로 발현할 것인가 아님 inactive form으로 발현한 후 나중에 active form을 만들 것인가 등을 고려하셔야 합니다. 물론 발현에 대한 전단계 부터 purification strategy도 생각하셔야겠죠... 일단 생각나는 데로 한번 적어봤습니다. 더 궁금한 점이 있으면 discussion을 이어 갔으면 합니다. >Yeast에서 분리한 eukaryotic gene(s)을 유산균과 같은 prokaryotes에서 expression시켜 보려고 합니다. > >cDNA만들기 --> gene 분리 --> cloning--> transfomation --> screening > >일의 전체적인 큰 그림의 순서나 각 순서상 유의해야 할 점들이 있다면 알고 싶습니다. 좋은 의견 부탁드립니다. > >

>Yeast에서 분리한 eukaryotic gene(s)을 유산균과 같은 prokaryotes에서 expression시켜 보려고 합니다. > >cDNA만들기 --> gene 분리 --> cloning--> transfomation --> screening > >일의 전체적인 큰 그림의 순서나 각 순서상 유의해야 할 점들이 있다면 알고 싶습니다. 좋은 의견 부탁드립니다. > > 윗 분이 일반적인 protein expression work에 대해 자세히 설명해 주셨고.. 전 lactic acid bacteria에서의 targeting system에 관한 paper를 올립니다..참고하시길... 그리고 덧붙이자면 prokaryote에서도 Shine-Dalgarno sequence같은 translation initiation site를 넣어야 translation잘됩니다. Purine rich sequence로..대충 비슷비슷하겠지만 translation efficiency가 크게 달라집니다...발현이 아예 안될 수도 있고요.. 그럼..