2005-10-26
org.kosen.entty.User@6ce591e6
김주미(imuj)
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제가 하는 실험 중에 endothelial cell + cell을 분리하는 단계가 있어서요,,
이떄 FACs를 이용하는데요..
Ab 를 surface AB-FITC conjugated를 , cytoplasmAb-PE를 1차.2차.staining해서 보고 있는데요... PE값은 잘 나오는데 반해.. FITC 가 나오질 않네요.... ㅜㅜ
부착세포를 enzyme( cell dissiciation buffer)처리를 해서 staining을 하는데요..
무엇이 문제인지~~ㅜㅜ
제가 이제 초년 생이라 endothelial,FACs 모두다 많이 부족해여~
도와 주세요~~ㅜㅜ
- endothelial cell
- FACs analysis
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답변 1
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답변
윤철희님의 답변
2005-10-26- 0
세포분리는 magnetic bead를 이용하는 방법에서부터 cell sorter에 이르기까지 대부분의 경우에 specific antibody에 의존을 하고 있습니다. 근본적으로 3가지를 생각해 볼 수 있습니다. (1) 기계 (FACSvantage or FACSaria)는 정상적으로 작동을 하고 reading, compensation, 분리가 잘 되도록 되어있는지.. (2) 세포상태는 양호한지.. cytoplasm protein에 대한 항체를 쓰신다면, permeablization을 할 수도 있는데.. 이런 경우의 staining에서는 세포 표면의 수용체 (아마도 endothelial cell에 특이적인것을 타겟할텐데.. ICAM, VCAM등)를 먼저 staining 하는것이 좋습니다. 또한 이때 수용체가 잘 발현되고 있지 않거나 충분한 수가 되지 않는다면.. 분리가 잘 안되어지고 (정확한 peak 구분이 안된다는거죠..) 따라서 sorting이 어려습니다. (3) 사용하는 두개의 항체가 실제로 잘 되는지의 확인.. 정도로 나누어 볼 수 있겠습니다. 각각의 경우가 다 발생할 수 있으며, 두가지가 동시에 문제가 될 수 있으므로 차분히 하나씩 (positive control(s)를 이용하여) 확인작업하심이 좋을듯 합니다. 그럼 좋은 연구 되세요.. >제가 하는 실험 중에 endothelial cell + cell을 분리하는 단계가 있어서요,, >이？？ FACs를 이용하는데요.. >Ab 를 surface AB-FITC conjugated를 , cytoplasmAb-PE를 1차.2차.staining해서 보고 있는데요... PE값은 잘 나오는데 반해.. FITC 가 나오질 않네요.... ㅜㅜ >부착세포를 enzyme( cell dissiciation buffer)처리를 해서 staining을 하는데요.. >무엇이 문제인지~~ㅜㅜ >제가 이제 초년 생이라 endothelial,FACs 모두다 많이 부족해여~ >도와 주세요~~ㅜㅜ