2005-11-20
org.kosen.entty.User@7069ba7d
서강식(sks1379)
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저는 colon cancer cell line에 어떠한 약물을 처리한 다음 그에 의해서 나타나는
apoptosis과정을 밝히고 있는 사람입니다.
그 결과 중에 다른 것들은 앞 뒤가 맞는 듯 한데 caspase-3에 대한 결과만 좀 이상하게
나오네요. 우선 western blot으로 time dependent하게 실험해 보면 시간이 지남에
따라서 pro-caspase-3 form은 감소하고(active form은 잘 안잡혀요 ㅠㅠ) PARP cleavage
는 확실히 증가합니다. 그리고 caspase-3 activity assay를 해도 72시간이 48시간보다
약간 감소는 합니다만 control에 비해 3~4배 가량 되구요. 근데 문제는 그 다음 입니다.
caspase inhibitor인 Z-VAD-fmk를 50uM 처리했는데 MTT assay상에서 효과가 없는 걸루
나타났구 FACS를 측정해도 그래프 상으로는 약간 Z-VAD-fmk의 효과가 있는 것 같은데
marker를 설정하여 percentage를 보면 효과가 없는 걸루 나옵니다.
즉, 제 질문은 이겁니다. western과 activity assay를 하면 caspase-3 dependent하게
apoptosis가 일어나는 것 같은데 Z-VAD-fmk를 처리하면 caspase-3 independent하게
apoptosis가 일어나는 것 같으니 이것 참 해석하기 어렵네요... 혹시 Z-VAD-fmk를
낮은 농도로 처리한 것인지도 의문가구요... 보통은 20uM만 해도 효과가 나타난다고들
하던데... 혹시 고수님들이 보신 논문같은 것들에서 이런 비슷한 결과를 어떻게든
해석해놓은 게 있으시거나 이런 비슷한 경험이 있으셨던 분들이 있다면 꼭 좀 조언
부탁드립니다. 제가 실험을 잘못 한걸 수도 있으니까요... 감사합니다 ^^
- apoptosis
- caspase-3
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 4
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답변
우하나님의 답변
2005-11-21- 0
caspase-3의 western 결과 만으로 apoptosis에 의해 cell death가 일어났다고 결론을 내리기는 힘듭니다. western 결과 proform이 없어진 것이 확인되었다면 activation으로 볼 수도 있으나 cell이 전반적으로 많이 죽어서 없어졌다거나, caspase-3도 활성화 된 후에 ubiquitination에 의한 degradation에 의해 제거되는 과정을 겪는 것으로 알려져있기 때문에 없어졌을 수도 있구요. active caspase-3를 잡는 antibody로 blot을 해보시는 것이 좋을 것 같습니다. 사용하신 z-VAD 농도는 충분합니다. 오히려 꽤 높게 쓰신 것 같습니다. 보통 20uM 정도 쓰는데요. 고농도로 사용하시면 caspase 이외의 다른 enzyme도 inhibition 할 수 있습니다. MTT는 mitochondria에 있는 enzyme activity(지금 정확히 기억이 안 나네요, 찾아보세요)를 측정하는 것이므로, 시약 같은 것 처리하고 나서 MTT로 얻은 결과도 cell death를 그대로 반영한다고 해석하시면 안됩니다. 가른 결과들과 맞아들어가는 경우에만 그렇게 해석하시는 것이 좋을것 같습니다. -
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전주홍님의 답변
2005-11-21- 0
한가지는 약물이 caspase-independent cell death를 유도하는 기전을 가질 수 있습니다. 대표적인 예가 apoptosis-inducing factor (AIF)에 의한 세포사멸 기전이 되겠지요... AIF가 활성화 되는 경우 미토콘드리아에서 핵안으로 이동되며, 이 때에는 caspase inhibitor를 처리해도 세포사멸이 억제되는 않는다는 보고가 많이 있습니다. 또한 저도 caspase inhibitor가지고 실험을 해 봤는데 caspase inhibitor 그 자체가 cell line별로 다르지만 어떤 세포주에서는 상당한 독성이 관찰된 적도 있었습니다. 물론 caspase-independent death를 유도하는 것이겠지요... > > 즉, 제 질문은 이겁니다. western과 activity assay를 하면 caspase-3 dependent하게 >apoptosis가 일어나는 것 같은데 Z-VAD-fmk를 처리하면 caspase-3 independent하게 >apoptosis가 일어나는 것 같으니 이것 참 해석하기 어렵네요... 혹시 Z-VAD-fmk를 >낮은 농도로 처리한 것인지도 의문가구요... 보통은 20uM만 해도 효과가 나타난다고들 >하던데... 혹시 고수님들이 보신 논문같은 것들에서 이런 비슷한 결과를 어떻게든 >해석해놓은 게 있으시거나 이런 비슷한 경험이 있으셨던 분들이 있다면 꼭 좀 조언 >부탁드립니다. 제가 실험을 잘못 한걸 수도 있으니까요... 감사합니다 ^^ -
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김인기님의 답변
2005-11-22- 0
초반기 Apoptosis연구에 의해서는 caspase activation일 일어나면 당연히 apoptosis라 보았지만 현재로서는 이러한 단편적인 윈도우로는 apoptosis를 정의하기 어렵습니다. 님께서 하신 실험중 MTT assay는 정확하게 말하자면 cell death assay가 아니라 cell proliferation assay에 해당하므로 정확한 결론을 얻으시려 한다면 FACS 데이터에 더 무게를 두시는 것이 좋습니다. 다른 회원도 쓰셨지만 zVAD는 25uM이상으로는 사용하지 않는 것이 좋습니다. 우리가 생각하는 화학적 저해제란 그 특성이 매우 정확한 물건들입니다. 그리고 Caspase-3 activation에 대한 loading control이 확실하다면, -3이외에도 -8,-9,-7등을 새로 시도하실 것을 권해봅니다. cell type에 따라 사멸신호를 전달하는 방식은 현재 type-1/2로 나뉘어지며 이들에 따라서 caspase가 활성화되는 양상도 다소 다릅니다. -
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문경준님의 답변
2005-12-08- 0
님께서 사용하시는 MTT는 다른 분께서 말씀하신 것처럼 mitochondria의 activity를 측정하는 것입다. apoptosis시에는 mitochondial function을 측정하기보단 nucleus condensation 을 보는게 확실하다고 생각되어집니다. 해서 MTT assay 말고 힘드시더라도 tunel assay를 해서 counting 하시는게 apoptotic death를 측정하는 옳은 방법인 것 같습니다.