2005-12-09
org.kosen.entty.User@149f26e1
서강식(sks1379)
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apoptosis를 일으키는 약물을 암세포에 처리한 후 western blot을 하려 합니다.
그런데 항상 난해한 것은 처리시간이 좀 된 plate의 cell들은 아직 붙어있는 것들과
이미 배지 상으로 떠버린(죽었는지 살았는지는 확인 불가, 제 cell은 붙어 자라는
cell) 것들이 생길 때 cell harvest시 떠버린 cell들도 함께 모아서 lysis를
시켜야하는지 아니면 떠버린 cell들은 버리고 아직 바닥에 붙어있는 헤롱거리는 cell들만
scraping 해서 모아 lysis를 시켜야 하는지 궁금합니다. 떠다니는 cell을 버리게되면
cell을 모았을 때 그 volume이 굉장히 적어질텐데... 지금까지는 배지까지 함께
모았었는데 갑자기 의구심이 드네요...western blot할 때 보게되는 그 기준이 어떤것인지... ㅠ.ㅠ
- apoptosis
- cell harvest
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답변 3
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답변
김성환님의 답변
2005-12-09- 0
apoptotic signal을 보고 싶으시면 농도별, 시간별 실험을 진행해 보세요. 어떤 논문에서는 FACS를 찍을때 떠 있는 세포까지 함께 prep하는 경우도 있지만 대부분의 western blot 실험에서는 배지에 있는 단백질을 제거하기 위해 PBS로 washing하고 실험을 하죠. 세포가 떠다닐 정도면 약물의 농도가 너무 높던가 아니면 처리 시간이 너무 길지는 않은지요? >apoptosis를 일으키는 약물을 암세포에 처리한 후 western blot을 하려 합니다. >그런데 항상 난해한 것은 처리시간이 좀 된 plate의 cell들은 아직 붙어있는 것들과 >이미 배지 상으로 떠버린(죽었는지 살았는지는 확인 불가, 제 cell은 붙어 자라는 >cell) 것들이 생길 때 cell harvest시 떠버린 cell들도 함께 모아서 lysis를 >시켜야하는지 아니면 떠버린 cell들은 버리고 아직 바닥에 붙어있는 헤롱거리는 cell들만 >scraping 해서 모아 lysis를 시켜야 하는지 궁금합니다. 떠다니는 cell을 버리게되면 >cell을 모았을 때 그 volume이 굉장히 적어질텐데... 지금까지는 배지까지 함께 >모았었는데 갑자기 의구심이 드네요...western blot할 때 보게되는 그 기준이 어떤것인지... ㅠ.ㅠ -
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윤철희님의 답변
2005-12-10- 0
우선 attached cell등이 suspension 상태로 된다면 일단 건강하지 않다고 판단을 할 수 있습니다. 물론 모든 실험은 디자인이 중요하므로, 시간에 따른 세포주의 변화(약물처리하지 않은경우)를 알고 있는것이 중요하겠죠. 그리고, 항상 실험의 반복성을 위하여 가능한 한 모든 조건들을 같게 실험을 해야 합니다. 즉, 배양조건, confluent rate (75%), 처리하지 않은 대조구, 시간이 경과하면서 나타나는 처리구와 대조구의 변화가 FACS를 하던, 웨스턴을 하던 중요한 factors가 됩니다. 그리고 약물처리 후 wash out 하는건 개인적으로는 반대합니다. 왜냐하면 약물에 의한 apoptosis 였다면 이들 세포는 suspension이 될것이고 이의 확인은 위에 말씀드린 것과 같이 대조구와의 비교를 하여야 합니다. 대조구에서도 같은 정도의 상태가 발견된다면, 시간이 너무 경과하였거나 배양조건이 맞지 않았다고 할 수 있겠죠. 좋은 실험되세요.. >apoptosis를 일으키는 약물을 암세포에 처리한 후 western blot을 하려 합니다. >그런데 항상 난해한 것은 처리시간이 좀 된 plate의 cell들은 아직 붙어있는 것들과 >이미 배지 상으로 떠버린(죽었는지 살았는지는 확인 불가, 제 cell은 붙어 자라는 >cell) 것들이 생길 때 cell harvest시 떠버린 cell들도 함께 모아서 lysis를 >시켜야하는지 아니면 떠버린 cell들은 버리고 아직 바닥에 붙어있는 헤롱거리는 cell들만 >scraping 해서 모아 lysis를 시켜야 하는지 궁금합니다. 떠다니는 cell을 버리게되면 >cell을 모았을 때 그 volume이 굉장히 적어질텐데... 지금까지는 배지까지 함께 >모았었는데 갑자기 의구심이 드네요...western blot할 때 보게되는 그 기준이 어떤것인지... ㅠ.ㅠ -
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정철웅님의 답변
2006-02-10- 0
>apoptosis를 일으키는 약물을 암세포에 처리한 후 western blot을 하려 합니다. >그런데 항상 난해한 것은 처리시간이 좀 된 plate의 cell들은 아직 붙어있는 것들과 >이미 배지 상으로 떠버린(죽었는지 살았는지는 확인 불가, 제 cell은 붙어 자라는 >cell) 것들이 생길 때 cell harvest시 떠버린 cell들도 함께 모아서 lysis를 >시켜야하는지 아니면 떠버린 cell들은 버리고 아직 바닥에 붙어있는 헤롱거리는 cell들만 >scraping 해서 모아 lysis를 시켜야 하는지 궁금합니다. 떠다니는 cell을 버리게되면 >cell을 모았을 때 그 volume이 굉장히 적어질텐데... 지금까지는 배지까지 함께 >모았었는데 갑자기 의구심이 드네요...western blot할 때 보게되는 그 기준이 어떤것인지... ㅠ.ㅠ 붙어있는 세포에 apoptosis를 유도 하면 사멸 유무를 얼마나 많은 세포가 떨어졌나로 판단 할 수 있습니다. 같은 plate에 있는 세포라 하더라도 셀사이클이 다르기 때문에 죽는 시간이 다르게 나타나서 그런 것이니 잘못되 조건은 아닙니다. 따라서 일반적으로 다 추후 어세이에 사용하는 것이 좋습니다. 다만 보고자 하는 목적에 따라 뜬 세포와 붙어 있는 것을 따로 모으는 사람도 있지만 과히 좋지는 않습니다. 좀더 homogeneous한 결과를 보고 싶다면 셀사이클을 arrest한 후 드럭을 처리하는 것도 한 방법입니다. 또 한가지 고려할 것은 처리한 시약에 stability인데요 얼마나 처리 하셨는지 모르지만 일정시간 이후에 처리한 약물이 다 분해 되어 유효 농도 밑으로 떨어져서 더이상의 세포 사멸이 진행 되지 않을 수도 있으니 이점도 고려하시기 바랍니다. 그럼 좋은 결과 얻으시길 빕니다.