2005-12-14
org.kosen.entty.User@fac5c5c
강성진(sj6796)
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제가 발현하려고 하는 protein은 Antifungal protein이며 10kD 정도 됩니다.
GST fusion 되있는 pGEX 4T-2 vector에 넣어져있구요. Novel한 gene이구요
GST는 expression되는데 제가 발현시키고자 하는 protein만
발현이 되지않습니다.
온도조건을 낮춰서도 해보고 배지조성도 다르게 해보고
IPTG농도도 바꿔서 해봤는데 안됩니다
어떻게 해야 할까요? 고수님들의 의견좀 바랍니다.
또 다른 방법없을까요?
- expression
- protein
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답변 2
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답변
김은민님의 답변
2005-12-14- 0
GST tag해서 단백질 induction이 잘 안되는 경우, 저 같은 경우 His tag system으로 바꿉니다. 단백질마다 가지고 있는 성격이 있기때문에 두가지 tagging을 모두 진행한답니다. pGEX 4T-2 vector라면 His는 pET28b로 cloning하시면 되겠네요. 그리고 induction하시고 western은 해 보셨는지요..? frame은 sequencing으로 confirm하셨겠지요? 모두 confirm하고도 안된다면 최후의 선택으로 tag를 바꾼답니다. normal condition에서 잘 안되는 단백질은 온도를 낮추든 IPTG 농도를 바꾸든간에.. 잘 안잡히는것같아요 (제 경험상요..) 또 GST의 경우 aggregation되어서 ppt로 떨어지는경운 solublization하는 system이 없기때문에 저희는 His tag을 선호한답니다. 또 궁금한게 있으시면 언제든지요.. 아자아자 화이팅입니다!! >제가 발현하려고 하는 protein은 Antifungal protein이며 10kD 정도 됩니다. >GST fusion 되있는 pGEX 4T-2 vector에 넣어져있구요. Novel한 gene이구요 >GST는 expression되는데 제가 발현시키고자 하는 protein만 >발현이 되지않습니다. >온도조건을 낮춰서도 해보고 배지조성도 다르게 해보고 >IPTG농도도 바꿔서 해봤는데 안됩니다 > >어떻게 해야 할까요? 고수님들의 의견좀 바랍니다. >또 다른 방법없을까요? > -
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전주홍님의 답변
2005-12-15- 0
첫번째는 in frame으로 cloning이 되었는지 확인해 보시길 바랍니다. 두번째는 sequencing을 통해서 염기서열의 정확성을 확실하게 해 두는 것이 좋을 듯 합니다. 염기서열이 잘못되어 termination codon이 generation 될 수 있습니다. 또한 fusion되는 서열 앞에 (GST와 target gene 사이) stop codon이 나오면 곤란하겠지요... 세번째는 fusion protein 자체가 독성을 나타내지는 않는지요... Growth pattern을 보면 알 수 있겠지요... 네번째는 extremely low expression일 수 있기 때문에 coomassie stain 뿐 아니라 western blot analysis로도 확인해 보시길 바랍니다. >제가 발현하려고 하는 protein은 Antifungal protein이며 10kD 정도 됩니다. >GST fusion 되있는 pGEX 4T-2 vector에 넣어져있구요. Novel한 gene이구요 >GST는 expression되는데 제가 발현시키고자 하는 protein만 >발현이 되지않습니다. >온도조건을 낮춰서도 해보고 배지조성도 다르게 해보고 >IPTG농도도 바꿔서 해봤는데 안됩니다 > >어떻게 해야 할까요? 고수님들의 의견좀 바랍니다. >또 다른 방법없을까요? >