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> 간암 세포 내의 Reactive Oxygen Species 중 hydrogen peroxide의 양을 측정하고자 합니다. > Molecular Probes이라는 회사에서 파는 H2DCFDA를 사용하는 것까지는 논문을 찾아봐서 알겠는 데 실제로 catalogue를 찾아보니 여러 derivative들도 나와서 무엇을 신청할 지 모르겠군요. 가장 다루기 쉽고 편하게 할 수 있는 것이 무엇인가요? > > 또, 그냥 live cell에서 보는 것이 아니라, 추가적으로 immunocytochemistry를 하기 위하여 fixation도 가능한 지도 알고 싶습니다. fixation하고 antibody를 붙이는 동안 signal이 사라질 것 같아서요. > > 마지막으로, hydrogen peroxide의 양을 수치화하여 비교하기 위해서는 측정하는 기계는 무엇을 사용하며, 어떻게 하는 건가요? 세포를 깨서 extract로 하지는 않을 것 같은 데.. > > 실제로 해 보신 경험이 있는 분의 고견을 듣고 싶습니다. > ROS중에서 hydrogen peroxide의 양을 측정하고 싶으시면, 가장 많이 사용되고 있는 dye인 H2DCFDA를 쓰시면 됩니다. 참고로 저는 sigma의 D-6883을 사용합니다. H2DCFDA는 live cell에서 ROS를 측정할 때 사용하죠. 세포를 immunocytochemistry를 하기 위해서 membrane에 구멍을 만들어 버리면, 안에 들어 있던 DCF들이 모두 밖으로 빠져나와서 형광 신호가 감지되질 못합니다. 즉, ROS의 측정과 immunocytochemistry를 따로 해야 한다는 얘기죠. 제가 학생들의 수업에 사용했던 PPT를 같이 올리니 이걸 보시면, 왜 ROS의 측정과 immunocytochemistry를 따로 해야 하는지에 대해서 아실겁니다. 그리고, H2DCFDA를 이용해서 ROS를 측정하는 가장 일반적인 방법은 FACS를 이용해서 신호를 분석하는 겁니다. 이렇게 하면, 형광신호, 즉, ROS의 증가 정도와 그 분포를 동시에 분석할 수가 있죠. 그런데, FACS분석이 여의치를 않다면 fluorescence reader를 이용해서도 측정이 가능합니다. 이미 알아 보셨겠지만, DCF는 녹색 형광을 발하죠. 그래서, 녹색 형광을 측정할 수 있는 microplate reader가 있다면, 이걸 이용해도 됩니다. 단 이때는 ROS의 분포는 알 수가 없고, 오로지 생성된 전체 ROS의 양만이 측정가능하다는 단점이 있습니다. 이 방법을 사용할때, 세포를 파괴하시면, 위에서 얘기한 것처럼 형광 신호를 검출할 수가 없습니다. well plate에 세포를 키워서 H2DCFDA를 처리 후에 reader로 읽으면 되죠. 어떤 랩에선 균일한 신호의 검출을 위해서 세포를 trypsin으로 처리해서 plate에서 떼어낸 후에 suspension 상태에서 측정을 하기도 합니다. 아무래도 세포란 녀석들이 plate에 아주 균일하게 퍼져서 자라는 것이 아니기 때문에, 신호 검출시에 차이가 발생할 수 있는 여지를 미연에 방지하기 위해서 suspension 상태에서 측정을 해주는 것이 낫죠. 그럼, 도움이 되었기를 바랍니다.

저도 실험한지 좀 오래되서 가물 가물하긴 한데.. 세포내에 있는 DCF는 형광을 측정할 수 있는Fluroscan이라는 기계를 사용해서 측정했습니다. 그리고 형광 현미경으로 세포내의 DCF 형광을 읽었는데 잘나오더군요.. > 간암 세포 내의 Reactive Oxygen Species 중 hydrogen peroxide의 양을 측정하고자 합니다. > Molecular Probes이라는 회사에서 파는 H2DCFDA를 사용하는 것까지는 논문을 찾아봐서 알겠는 데 실제로 catalogue를 찾아보니 여러 derivative들도 나와서 무엇을 신청할 지 모르겠군요. 가장 다루기 쉽고 편하게 할 수 있는 것이 무엇인가요? > > 또, 그냥 live cell에서 보는 것이 아니라, 추가적으로 immunocytochemistry를 하기 위하여 fixation도 가능한 지도 알고 싶습니다. fixation하고 antibody를 붙이는 동안 signal이 사라질 것 같아서요. > > 마지막으로, hydrogen peroxide의 양을 수치화하여 비교하기 위해서는 측정하는 기계는 무엇을 사용하며, 어떻게 하는 건가요? 세포를 깨서 extract로 하지는 않을 것 같은 데.. > > 실제로 해 보신 경험이 있는 분의 고견을 듣고 싶습니다. >

안녕하세요, 오랫동안 도망가 있다 보니, 등장하기가 쑥스러워서 눈팅만 하다가 글 남깁니다. 저번에 브릭에 답변 해 놓은거를 다시 올립니다. 허접 답변 이니 참고만 해주시기를 바랍니다. ^^;;; 1. --------------------------------------------------------- 고생 많으십니다. ^^; 급하다구 그러셨는데, 브릭에 너무 늦게 와서 이제 답 드리네요. 저 역시 형광 reader로 DCF 사용해서 형광을 측정 했는데요, 생각보다 쉽지 않더라구요. 첫째로 DCF는 빛에 매우 민감하므로 실험 중에는 최대한 빛의 노출을 줄여야 하구요 (너무 기본인가? ^^;;), 항상 fresh한 용액과 dye를 사용하셔야 깨끗한 결과를 얻으실수 있습니다. DCF2-DA 는 세포를 투과해서 세포내에 존재 하는 걸로 알고 있습니다.(안에서 DA가 짤리고, DCF-2만 존재); 30분 정도 incubation 시키신 후에, agonist (만약 drug 등을 test할 목적이면 미리 incubation 시킨후에 dye를 적용 시키는 것이 낳겠죠?) 를 처리하고, 바로 측정에 들어가서 시간대 별로 보는 것이 좋습니다. 물론, 이 시간 동안에는, 사용하시는 용액이 쇼크에 적절히 견디도록 하는 용매를 사용하시구요.. (cell culture medium은 별로 안 좋은거 같더라구요, 간섭이 많은것 같았슴, 개인적으로 Hank's solution을 추천드립니다.), 당연히 plate는 37도를 유지해 주는것이 좋겠죠. 그 다음에 재현성 있는 결과를 얻으 실려면, 세포수 등을 항상 유의깊게 살펴 보아야 할거 같습니다. 사용하시는 plate는 형광에 특별히 사용하는 plate를 사용하고 계시겠죠? black 과 white중에 black 은 background를 많이 없애 줘서 specific한 결과를 얻을 수 있지만, (ROS를 많이 만들어 내는 mast cell 등에 적당하죠), smooth muscle cell 처럼 ROS formation이 적은 경우는 힘들 수가 있습니다. 이럴 경우에는 white plate를 사용하시면 증폭된 결과를 얻으 실수 있습니다. 물론 단점으로 background를 신경 쓰셔야 합니다. 일반 plate를 사용하셨다면, 결과는 정말 제 마음대로 나오고, 믿을 수도 없는거 잘 아시죠? (혹시나 노파심에.. ^^;) ROS 측정은 ROS자체가 매우 불안정 하기 때문에 제대로 측정 하기가 쉽지 않습니다. 요즘 들어서는 confocal microscopy로 측정을 많이 하구요, 그 다음으로 spin trap을 이용해서 resornance를 이용해 측정을 합니다. 형광 dye를 사용하는거 보다, 훨씬 안정적이고 제대로 (주변 간섭을 거의 배제 시킨) 결과를 얻을 수 있는거 같습니다. 저는 요즘에 spin trap을 사용해서 측정 하는데.. 음.. 좋더군요. NO radical 만을 specific하게 측정 할 수 있구요, 또는 total ROS를 측정 할 수도 있구요. 만약 DCF를 사용해서 측정 하신다면, 항상 positive control을 써서, 실험이 제대로 수행 되었는지 확인 하시기를 추천 드립니다. positive control 로는 MnTpMpYp (철자가 맞는지 모르겠네.. ㅡㅡ;), SOD를 사용하시구요, 세포 내의 ROS를 보시는 경우라면, PEG-MnTpMpYp 나 PEG-SOD를 사용하시면 됩니다. 경우에 따라서 VitC나 NAC등을 사용하실 수도 있지만, 저의 경우는 역시 재현성 있는 결과를 얻기 힘들었습니다. 아시다 시피 VitC나 NAC도 워낙 많은 양을 넣어 줘야 anti-oxidant 효과를 나타내기 때문에 별로 좋은 positive control은 아닌거 같습니다. 혹은 DPI 를 사용하셔도 됩니다. 실험 목적에 따라 틀리겠지만, intracellular ROS 의 source는 대부분 NAD(P)H oxidase 류 이므로 이 inhibitor인 DPI를 사용하시는 것두 하나의 방법이 되겠고, intracellular source (agonist의) 를 찾는데 유용하게 쓰일 수 있겠죠. 님의 실험 목적을 모르기 때문에 정확한 상담은 해 드리지 못하고, 두루뭉실 중구난방.. (항상 제 답변이 그렇지만.. ^^;) 하게 답 드립니다. 도움이 됐으면 좋겠습니다. 아 한가지. 형광이 워낙 빨리 손실 된다구 그러셨는데, 제가 했던 바에 의하면, 일단 ROS 가 생성되면 형광이 나오고, 이 형광은 보통 (조건을 잘 잡아 주시고, 주위 환경이 잘 되어 있다면) 1시간 까지는 계속 accumulation 되는거 같습니다. 이만..진짜 끝!

in vitro상에서는 형광fluoreometer나 세포내에서는 confocal로 roi를 설정해서 측정하면 됩니다