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지식나눔

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Apoptosis 관련질문입니다.

2006-01-02 org.kosen.entty.User@779f0930 구광본(kkb418)
  • 3
RINm5F cell line에서 Apoptosis를 볼려고합니다. 저희 실험실에 FACS나 형광현미경은 없습니다 그냥 키트같은거를 사용해서 해야 할것 같은데 기본적으로 apoptosis인지볼려고 할때 assay 방법이 있는지 궁금합니다.... western blot을 이용해 antibody PARP를 사용해도 되는지도 알려주세요. 관련논문이나. 구체적방법도 부탁드립니다. 더좋은 방법이 있다면 알려주심 감사하겠습니다.
  • apoptosis
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답변 3
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    김성환님의 답변

    2006-01-02
    • 0
    님의 의견대로 apoptosis와 관련된 단백질들의 발현을 살펴보는 것으로도 확인할 수 있을 것으로 생각됩니다만, 다양한 항체를 사용하면 더욱 좋겠죠^^ apoptosis 관련 항체 sampler kit를 어디선가 본 것 같은데..^^ 혹 필요하시면 찾아서 알려드리죠. -> Merck_Calbiochem에서는 Apoptosis antibody sampler kit(human_cat no. ASK06)을 팔고 있습니다. 참고하세요. 계신 곳은 어딘지는 모르겠는데 가까운 실험실에 FACS가 있다면 annexin V/PI assay로 패턴을 보는 것이 더욱 좋을 것 같습니다. 연대 임상의학연구센터에서는 샘플을 가지고 오면 FACS를 찍어 주기도 한답니다.^^
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    님의 의견대로 apoptosis와 관련된 단백질들의 발현을 살펴보는 것으로도 확인할 수 있을 것으로 생각됩니다만, 다양한 항체를 사용하면 더욱 좋겠죠^^ apoptosis 관련 항체 sampler kit를 어디선가 본 것 같은데..^^ 혹 필요하시면 찾아서 알려드리죠. -> Merck_Calbiochem에서는 Apoptosis antibody sampler kit(human_cat no. ASK06)을 팔고 있습니다. 참고하세요. 계신 곳은 어딘지는 모르겠는데 가까운 실험실에 FACS가 있다면 annexin V/PI assay로 패턴을 보는 것이 더욱 좋을 것 같습니다. 연대 임상의학연구센터에서는 샘플을 가지고 오면 FACS를 찍어 주기도 한답니다.^^
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  • 답변

    전주홍님의 답변

    2006-01-02
    • 0
    Caspase-depedent apoptosis라면 final executor인 caspase-3 activity assay를 할 수 있습니다. fluorometric assay, colorimetric assay 모두 가능합니다. Kit를 구입하지 않으셔도 substrate만 따로 구입해서 실험할 수도 있습니다. 이 방법은 biochemical assay죠... 실제 세포 내에서의 활성은 caspase-3의 기질인 PARP cleavage를 Western blotting으로 확인할 수 있습니다. 물론 caspase-3도 proteolytic cleavage에 의해 활성이 증가하므로 caspase-3 cleavage를 Western blotting으로 확인할 수 있습니다. Capase-3 하위 경로에서 DNA laddering이 생기므로 genomic DNA 추출 후 agarose gel electrophoresis를 할 수 있지만 상피세포주에서는 다소 내공이 필요하기도 합니다. 물론 caspase pan inhibitor를 처리했을 때 세포사멸이 억제되면 caspase-dependent apoptosis임을 확인할 수도 있죠. Caspase-independent apoptosis일 경우 좀 골치아픈데 가장 대표적인 경로는 AIF에 의해 일어나는 경우입니다. AIF의 활성화는 Mitochondria에서 nucleus로 translocation이 되는 것을 subcellular fractionation을 통해 확인할 수 있습니다. AIF에 의해서는 DNA laddering이 아니라 large fragmentation이 일어나는데 이는 pulse-field electrophoresis를 해야 하는데 쉽지 않습니다. >RINm5F cell line에서 Apoptosis를 볼려고합니다. >저희 실험실에 FACS나 형광현미경은 없습니다 >그냥 키트같은거를 사용해서 해야 할것 같은데 기본적으로 apoptosis인지볼려고 할때 assay 방법이 있는지 궁금합니다.... > >western blot을 이용해 antibody PARP를 사용해도 되는지도 알려주세요. >관련논문이나. 구체적방법도 부탁드립니다. >더좋은 방법이 있다면 알려주심 감사하겠습니다.
    답변수정
    Caspase-depedent apoptosis라면 final executor인 caspase-3 activity assay를 할 수 있습니다. fluorometric assay, colorimetric assay 모두 가능합니다. Kit를 구입하지 않으셔도 substrate만 따로 구입해서 실험할 수도 있습니다. 이 방법은 biochemical assay죠... 실제 세포 내에서의 활성은 caspase-3의 기질인 PARP cleavage를 Western blotting으로 확인할 수 있습니다. 물론 caspase-3도 proteolytic cleavage에 의해 활성이 증가하므로 caspase-3 cleavage를 Western blotting으로 확인할 수 있습니다. Capase-3 하위 경로에서 DNA laddering이 생기므로 genomic DNA 추출 후 agarose gel electrophoresis를 할 수 있지만 상피세포주에서는 다소 내공이 필요하기도 합니다. 물론 caspase pan inhibitor를 처리했을 때 세포사멸이 억제되면 caspase-dependent apoptosis임을 확인할 수도 있죠. Caspase-independent apoptosis일 경우 좀 골치아픈데 가장 대표적인 경로는 AIF에 의해 일어나는 경우입니다. AIF의 활성화는 Mitochondria에서 nucleus로 translocation이 되는 것을 subcellular fractionation을 통해 확인할 수 있습니다. AIF에 의해서는 DNA laddering이 아니라 large fragmentation이 일어나는데 이는 pulse-field electrophoresis를 해야 하는데 쉽지 않습니다. >RINm5F cell line에서 Apoptosis를 볼려고합니다. >저희 실험실에 FACS나 형광현미경은 없습니다 >그냥 키트같은거를 사용해서 해야 할것 같은데 기본적으로 apoptosis인지볼려고 할때 assay 방법이 있는지 궁금합니다.... > >western blot을 이용해 antibody PARP를 사용해도 되는지도 알려주세요. >관련논문이나. 구체적방법도 부탁드립니다. >더좋은 방법이 있다면 알려주심 감사하겠습니다.
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  • 답변

    김기윤님의 답변

    2006-01-02
    • 0
    >RINm5F cell line에서 Apoptosis를 볼려고합니다. >저희 실험실에 FACS나 형광현미경은 없습니다 >그냥 키트같은거를 사용해서 해야 할것 같은데 기본적으로 apoptosis인지볼려고 할때 assay 방법이 있는지 궁금합니다.... > >western blot을 이용해 antibody PARP를 사용해도 되는지도 알려주세요. >관련논문이나. 구체적방법도 부탁드립니다. >더좋은 방법이 있다면 알려주심 감사하겠습니다. 물론 Facs를 이용하여 cell sorting을 하는게 확실하지만, 확인이야 genomic DNA를 뽑아서 agarose gel상에서 DNA laddering을 보는게 제일 간단하지 않을까 싶네요. 확실히 apoptosis가 유발된거랑, 아닌거, Necrosis랑은 구별이 될 테니까요. 또 여러가지 apoptotic marker protein에 대한 antibody를 이용한 western도 가능하겠지요. 이상은 특별한 방법이 필요없는 쉬운 방법으로의 apoptosis확이법이었습니다. 끝
    답변수정
    >RINm5F cell line에서 Apoptosis를 볼려고합니다. >저희 실험실에 FACS나 형광현미경은 없습니다 >그냥 키트같은거를 사용해서 해야 할것 같은데 기본적으로 apoptosis인지볼려고 할때 assay 방법이 있는지 궁금합니다.... > >western blot을 이용해 antibody PARP를 사용해도 되는지도 알려주세요. >관련논문이나. 구체적방법도 부탁드립니다. >더좋은 방법이 있다면 알려주심 감사하겠습니다. 물론 Facs를 이용하여 cell sorting을 하는게 확실하지만, 확인이야 genomic DNA를 뽑아서 agarose gel상에서 DNA laddering을 보는게 제일 간단하지 않을까 싶네요. 확실히 apoptosis가 유발된거랑, 아닌거, Necrosis랑은 구별이 될 테니까요. 또 여러가지 apoptotic marker protein에 대한 antibody를 이용한 western도 가능하겠지요. 이상은 특별한 방법이 필요없는 쉬운 방법으로의 apoptosis확이법이었습니다. 끝
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