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지식나눔

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특이한 cloning!

2006-01-02 org.kosen.entty.User@38c66724 민보경(mbrose)
  • 3
150bp 유전자를 pGEM-T easy vector에 넣고 ECOS 101 competent cells에 transformation을 실시해서 X-gal/IPTG LB plate에서 blue/white colony를 얻었습니다. (이때 control도 동일한 방법으로 실시함) 문제는 액체 배지에 배양을 하는데 control은 제대로 배양이 잘되는데 150 bp 유전자를 갖는 colonies은 전혀 배양이 되질 않습니다. 우선 유전자가 제대로 들어갔는지 확인하기 위해 colony PCR을 실시해서 유전자가 제대로 들어간 것은 확인을 했습니다. 참고로 저는 분자생물학쪽일을 요즘 조금 배우고 있는데 정말 난감하군요. 고수님들의 좋은 의견 부탁드립니다. 150 bp gene은 human Cart-1 gene입니다.
  • Cloning
  • Cart-1
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    김은민님의 답변

    2006-01-02
    • 0
    별의 별 일들이 많이 일어난답니다. plasmid 자체의 growth 자체가 무지 느리지는 않는지 의심을 해보세요. 즉..보통 16시간 키우는 bacteria를 24시간 혹은 그 이상 키워보세요. 유전자 자체가 가지고 있는 toxicity로 인하여 잘 자라지 않을 수도 있거든요. 또 하나, colony PCR 시에 positive control 만큼의 intencity로 PCR이 잘 되었나요? PCR 자체가 무지 흐리다면 contamination인 경우가 대다수랍니다. 그래서 보통 cloning한 primer로 PCR하지 않구요. vector가 가지고 있는 commercial한 primer를 사용하기도 합니다. 예를들어 M13 F+R와 같은 primer로요~ 다시한번 confirm해 보세요~ 둘중에 하나가 아닌가 하네요~ 으싸으싸..분자생물학쪽 일이..생각보다 일이 많고 결과가 적은게 단점이랍니다. 건승!!기원드립니다. 복 많이 받으세요~~*^^*~~ >150bp 유전자를 pGEM-T easy vector에 넣고 >ECOS 101 competent cells에 transformation을 >실시해서 X-gal/IPTG LB plate에서 blue/white >colony를 얻었습니다. (이때 control도 동일한 >방법으로 실시함) > >문제는 액체 배지에 배양을 하는데 control은 >제대로 배양이 잘되는데 150 bp 유전자를 갖는 >colonies은 전혀 배양이 되질 않습니다. 우선 >유전자가 제대로 들어갔는지 확인하기 위해 >colony PCR을 실시해서 유전자가 제대로 들어간 >것은 확인을 했습니다. > >참고로 저는 분자생물학쪽일을 요즘 조금 배우고 >있는데 정말 난감하군요. 고수님들의 좋은 의견 >부탁드립니다. > >150 bp gene은 human Cart-1 gene입니다.
    답변수정
    별의 별 일들이 많이 일어난답니다. plasmid 자체의 growth 자체가 무지 느리지는 않는지 의심을 해보세요. 즉..보통 16시간 키우는 bacteria를 24시간 혹은 그 이상 키워보세요. 유전자 자체가 가지고 있는 toxicity로 인하여 잘 자라지 않을 수도 있거든요. 또 하나, colony PCR 시에 positive control 만큼의 intencity로 PCR이 잘 되었나요? PCR 자체가 무지 흐리다면 contamination인 경우가 대다수랍니다. 그래서 보통 cloning한 primer로 PCR하지 않구요. vector가 가지고 있는 commercial한 primer를 사용하기도 합니다. 예를들어 M13 F+R와 같은 primer로요~ 다시한번 confirm해 보세요~ 둘중에 하나가 아닌가 하네요~ 으싸으싸..분자생물학쪽 일이..생각보다 일이 많고 결과가 적은게 단점이랍니다. 건승!!기원드립니다. 복 많이 받으세요~~*^^*~~ >150bp 유전자를 pGEM-T easy vector에 넣고 >ECOS 101 competent cells에 transformation을 >실시해서 X-gal/IPTG LB plate에서 blue/white >colony를 얻었습니다. (이때 control도 동일한 >방법으로 실시함) > >문제는 액체 배지에 배양을 하는데 control은 >제대로 배양이 잘되는데 150 bp 유전자를 갖는 >colonies은 전혀 배양이 되질 않습니다. 우선 >유전자가 제대로 들어갔는지 확인하기 위해 >colony PCR을 실시해서 유전자가 제대로 들어간 >것은 확인을 했습니다. > >참고로 저는 분자생물학쪽일을 요즘 조금 배우고 >있는데 정말 난감하군요. 고수님들의 좋은 의견 >부탁드립니다. > >150 bp gene은 human Cart-1 gene입니다.
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  • 답변

    김기윤님의 답변

    2006-01-03
    • 0
    >150bp 유전자를 pGEM-T easy vector에 넣고 >ECOS 101 competent cells에 transformation을 >실시해서 X-gal/IPTG LB plate에서 blue/white >colony를 얻었습니다. (이때 control도 동일한 >방법으로 실시함) > >문제는 액체 배지에 배양을 하는데 control은 >제대로 배양이 잘되는데 150 bp 유전자를 갖는 >colonies은 전혀 배양이 되질 않습니다. 우선 >유전자가 제대로 들어갔는지 확인하기 위해 >colony PCR을 실시해서 유전자가 제대로 들어간 >것은 확인을 했습니다. > >참고로 저는 분자생물학쪽일을 요즘 조금 배우고 >있는데 정말 난감하군요. 고수님들의 좋은 의견 >부탁드립니다. > >150 bp gene은 human Cart-1 gene입니다. insert한 유전자가 E.coli에 toxic한 단백질을 만들어내는게 아닌가 싶은데요. 이런 경우 지금 잘 기억은 안나는데, E.coli strain중에 발현을 정교하게 control할 수 있는 균주가 있다고 하던데 그걸 사용하면 된다고 하더라구요. 즉 대장균을 일정기간 목적 단백질 발현시키지 않고 배양만 하다가 짧은 시간동안만 중점적으로 발현시키는 거지요. 하시는 일 잘 되시길..
    답변수정
    >150bp 유전자를 pGEM-T easy vector에 넣고 >ECOS 101 competent cells에 transformation을 >실시해서 X-gal/IPTG LB plate에서 blue/white >colony를 얻었습니다. (이때 control도 동일한 >방법으로 실시함) > >문제는 액체 배지에 배양을 하는데 control은 >제대로 배양이 잘되는데 150 bp 유전자를 갖는 >colonies은 전혀 배양이 되질 않습니다. 우선 >유전자가 제대로 들어갔는지 확인하기 위해 >colony PCR을 실시해서 유전자가 제대로 들어간 >것은 확인을 했습니다. > >참고로 저는 분자생물학쪽일을 요즘 조금 배우고 >있는데 정말 난감하군요. 고수님들의 좋은 의견 >부탁드립니다. > >150 bp gene은 human Cart-1 gene입니다. insert한 유전자가 E.coli에 toxic한 단백질을 만들어내는게 아닌가 싶은데요. 이런 경우 지금 잘 기억은 안나는데, E.coli strain중에 발현을 정교하게 control할 수 있는 균주가 있다고 하던데 그걸 사용하면 된다고 하더라구요. 즉 대장균을 일정기간 목적 단백질 발현시키지 않고 배양만 하다가 짧은 시간동안만 중점적으로 발현시키는 거지요. 하시는 일 잘 되시길..
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    전주홍님의 답변

    2006-01-03
    • 0
    유전자 클로닝 쪽 분야는 참 말도 많고 탈도 많은 분야입니다. pGEM-T easy vector가 아마 promega에서 나온 PCR product 클로닝용 T-vector 종류인걸로 기억됩니다. 단백질 발현용 vector는 아니었던 것 같구요... 아마 발현을 위해서는 다른 벡터로 옮기셔야겠죠...그런데 일반 클로닝용 벡터임에도 단백질이 발현되기도 합니다. 물론 plasmid 자체의 독성인지 e단백질의 독성인지는 구분하기 힘들겠죠... 이 construct가 들어간 대장균을 액체배지에서 계속해서 배양할 계획이 아니시라면 agar plate에서는 자라니까 colony를 배지로 적절히 dilution 해서 agar plate에 plating을 해서 키워도 됩니다. plasmid를 뽑아내는데에는 큰 문제가 없습니다. 만약 지속적으로 액체배지에서 배양해야 한다면 vector system을 바꾸는 것을 고려해 보셔야 할 것도 같은데요... 이쪽 일이 이유는 찾는데 시간이 많이 경우도 있는데 시스템을 바꾸어서 간단히 해결되는 예도 굉장히 많거든요... >150bp 유전자를 pGEM-T easy vector에 넣고 >ECOS 101 competent cells에 transformation을 >실시해서 X-gal/IPTG LB plate에서 blue/white >colony를 얻었습니다. (이때 control도 동일한 >방법으로 실시함) > >문제는 액체 배지에 배양을 하는데 control은 >제대로 배양이 잘되는데 150 bp 유전자를 갖는 >colonies은 전혀 배양이 되질 않습니다. 우선 >유전자가 제대로 들어갔는지 확인하기 위해 >colony PCR을 실시해서 유전자가 제대로 들어간 >것은 확인을 했습니다. > >참고로 저는 분자생물학쪽일을 요즘 조금 배우고 >있는데 정말 난감하군요. 고수님들의 좋은 의견 >부탁드립니다. > >150 bp gene은 human Cart-1 gene입니다.
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    유전자 클로닝 쪽 분야는 참 말도 많고 탈도 많은 분야입니다. pGEM-T easy vector가 아마 promega에서 나온 PCR product 클로닝용 T-vector 종류인걸로 기억됩니다. 단백질 발현용 vector는 아니었던 것 같구요... 아마 발현을 위해서는 다른 벡터로 옮기셔야겠죠...그런데 일반 클로닝용 벡터임에도 단백질이 발현되기도 합니다. 물론 plasmid 자체의 독성인지 e단백질의 독성인지는 구분하기 힘들겠죠... 이 construct가 들어간 대장균을 액체배지에서 계속해서 배양할 계획이 아니시라면 agar plate에서는 자라니까 colony를 배지로 적절히 dilution 해서 agar plate에 plating을 해서 키워도 됩니다. plasmid를 뽑아내는데에는 큰 문제가 없습니다. 만약 지속적으로 액체배지에서 배양해야 한다면 vector system을 바꾸는 것을 고려해 보셔야 할 것도 같은데요... 이쪽 일이 이유는 찾는데 시간이 많이 경우도 있는데 시스템을 바꾸어서 간단히 해결되는 예도 굉장히 많거든요... >150bp 유전자를 pGEM-T easy vector에 넣고 >ECOS 101 competent cells에 transformation을 >실시해서 X-gal/IPTG LB plate에서 blue/white >colony를 얻었습니다. (이때 control도 동일한 >방법으로 실시함) > >문제는 액체 배지에 배양을 하는데 control은 >제대로 배양이 잘되는데 150 bp 유전자를 갖는 >colonies은 전혀 배양이 되질 않습니다. 우선 >유전자가 제대로 들어갔는지 확인하기 위해 >colony PCR을 실시해서 유전자가 제대로 들어간 >것은 확인을 했습니다. > >참고로 저는 분자생물학쪽일을 요즘 조금 배우고 >있는데 정말 난감하군요. 고수님들의 좋은 의견 >부탁드립니다. > >150 bp gene은 human Cart-1 gene입니다.
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