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지식나눔

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fluorescence labeling 방법에 대해 부탁드립니다.

2006-01-05 org.kosen.entty.User@1e91ec43 심관섭(gwansub)
  • 2
peptide 또는 단백질에 fluorescence를 labeling 하여 세포내에서 확인하려고 합니다. 이렇게 peptide 또는 단백질에 fluorescence을 labeling하는 방법을 알려주셨으면 감사하겠습니다. 혹! 관련시약 또는 kit이 있다면 답변좀 부탁드리겠습니다.
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답변 2
  • 답변

    이영삼님의 답변

    2006-01-06
    • 0
    제일 싸고 간단한 방법은 FITC 를 Sigma에서 구입해서 단백질을 라벨링 하는 것입니다. 간단한 과정을 설명하면: (1) 단백질을 amine-free 버퍼에 녹인다. (HEPES나 sodium bicarbonate 사용할 것. Tris는 primary amine이 있어서 라벨링을 방해함). 이 때, pH가 중요한 역할을 함. pH 7이상 10이하로 유지할 것. 보통 optimal pH는 8-9 정도임. 단백질 농도는 1 mg/ml 이상에서 가장 효율적임. (2) FITC를 DMSO에 녹인다. (3) 단백질에 비해서 FITC를 대략 40-50 배 excess로 넣는다. (4) RT에서 1시간 또는 4도 에서 4-5시간 정도 Shake (5) 원하는 경우, 반응을 중지시킴 (Tris buffer나 ethanolamine 같은 amine류를 다량으로 첨가). (6) Size-exclusion column으로 정제한다. (Sephadex G-25 등등) (7) Mass spec이나 UV-VIS 흡광도로 단백질당 라벨링 정도를 측정한다. 단, 위의 경우처럼 FITC나 TRITC를 사용하여 라벨링하는 경우에는, 장기보관시 단백질에서 라벨이 떨어져나올 수 있음. 만약 예산에 여유가 있다면 molecular probes (invitrogen)에서 판매하는 Alexa Fluor 488 N-hydroxysuccinimide ester (카탈로그 A-20000)를 사용할 것을 권하구요. 이경우에는 라벨이 상당히 고가라는 단점이 있습니다. Kit로도 판매하는데 (카탈로그 A-20181), 키트당 300불 정도니까요. 위의 FITC 같은 라벨과 비교시, 형광은 거의 비슷한 색이 나옵니다. 알렉사의 경우 photobleaching 이 적은 관계로 좀 더 선명한 imaging이 가능하고, N-hydroxysuccinimide를 사용하는 관계로 단백질에 결합된 라벨이 좀 더 오래갑니다. 또한 라벨이 수용성이라는 것도 장점이구요. 비싸다는 것이 단점이군요. 웹사이트에 가시면 보다 자세한 사용법이 나오는데, 대략적인 방법은 위의 FITC경우와 흡사합니다. > >peptide 또는 단백질에 fluorescence를 labeling 하여 세포내에서 확인하려고 합니다. > >이렇게 peptide 또는 단백질에 fluorescence을 labeling하는 방법을 알려주셨으면 감사하겠습니다. 혹! 관련시약 또는 kit이 있다면 답변좀 부탁드리겠습니다.
    답변수정
    제일 싸고 간단한 방법은 FITC 를 Sigma에서 구입해서 단백질을 라벨링 하는 것입니다. 간단한 과정을 설명하면: (1) 단백질을 amine-free 버퍼에 녹인다. (HEPES나 sodium bicarbonate 사용할 것. Tris는 primary amine이 있어서 라벨링을 방해함). 이 때, pH가 중요한 역할을 함. pH 7이상 10이하로 유지할 것. 보통 optimal pH는 8-9 정도임. 단백질 농도는 1 mg/ml 이상에서 가장 효율적임. (2) FITC를 DMSO에 녹인다. (3) 단백질에 비해서 FITC를 대략 40-50 배 excess로 넣는다. (4) RT에서 1시간 또는 4도 에서 4-5시간 정도 Shake (5) 원하는 경우, 반응을 중지시킴 (Tris buffer나 ethanolamine 같은 amine류를 다량으로 첨가). (6) Size-exclusion column으로 정제한다. (Sephadex G-25 등등) (7) Mass spec이나 UV-VIS 흡광도로 단백질당 라벨링 정도를 측정한다. 단, 위의 경우처럼 FITC나 TRITC를 사용하여 라벨링하는 경우에는, 장기보관시 단백질에서 라벨이 떨어져나올 수 있음. 만약 예산에 여유가 있다면 molecular probes (invitrogen)에서 판매하는 Alexa Fluor 488 N-hydroxysuccinimide ester (카탈로그 A-20000)를 사용할 것을 권하구요. 이경우에는 라벨이 상당히 고가라는 단점이 있습니다. Kit로도 판매하는데 (카탈로그 A-20181), 키트당 300불 정도니까요. 위의 FITC 같은 라벨과 비교시, 형광은 거의 비슷한 색이 나옵니다. 알렉사의 경우 photobleaching 이 적은 관계로 좀 더 선명한 imaging이 가능하고, N-hydroxysuccinimide를 사용하는 관계로 단백질에 결합된 라벨이 좀 더 오래갑니다. 또한 라벨이 수용성이라는 것도 장점이구요. 비싸다는 것이 단점이군요. 웹사이트에 가시면 보다 자세한 사용법이 나오는데, 대략적인 방법은 위의 FITC경우와 흡사합니다. > >peptide 또는 단백질에 fluorescence를 labeling 하여 세포내에서 확인하려고 합니다. > >이렇게 peptide 또는 단백질에 fluorescence을 labeling하는 방법을 알려주셨으면 감사하겠습니다. 혹! 관련시약 또는 kit이 있다면 답변좀 부탁드리겠습니다.
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  • 답변

    정철웅님의 답변

    2006-02-09
    • 0
    > >peptide 또는 단백질에 fluorescence를 labeling 하여 세포내에서 확인하려고 합니다. > >이렇게 peptide 또는 단백질에 fluorescence을 labeling하는 방법을 알려주셨으면 감사하겠습니다. 혹! 관련시약 또는 kit이 있다면 답변좀 부탁드리겠습니다. Fluorescence protein이 있는 벡터에 유전자를 클로닝해서 실험하는 방법이 있습니다. www.clontech.com 에 가보시면 GFP,RFP,CFP,YFP 등 다양한 색깔과 다양한 용도로 사요하실 수 있습니다. 단점은 약 25 Kd정도의 형광 단백질이 추가 되기 때문에 원래 단백질에 여러가지 면에 서 영향을 줄 수 있습니다. 요즘은 nano particle을 이용하여 labeling하는 방법도 있습니다. 이것은 퀀텀 닷(?)이라고 불리우는 것으로 기억하는데 가장 오리지날 단백질에 영향을 안주는 방법입니다.
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    > >peptide 또는 단백질에 fluorescence를 labeling 하여 세포내에서 확인하려고 합니다. > >이렇게 peptide 또는 단백질에 fluorescence을 labeling하는 방법을 알려주셨으면 감사하겠습니다. 혹! 관련시약 또는 kit이 있다면 답변좀 부탁드리겠습니다. Fluorescence protein이 있는 벡터에 유전자를 클로닝해서 실험하는 방법이 있습니다. www.clontech.com 에 가보시면 GFP,RFP,CFP,YFP 등 다양한 색깔과 다양한 용도로 사요하실 수 있습니다. 단점은 약 25 Kd정도의 형광 단백질이 추가 되기 때문에 원래 단백질에 여러가지 면에 서 영향을 줄 수 있습니다. 요즘은 nano particle을 이용하여 labeling하는 방법도 있습니다. 이것은 퀀텀 닷(?)이라고 불리우는 것으로 기억하는데 가장 오리지날 단백질에 영향을 안주는 방법입니다.
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