KOSEN 한인과학기술자네트워크

berry friend 방법을 확립한 M.N. Berry가 작성한 리뷰 논문입니다. 여기서 132 페이지 하단부 부터 berry friend 방법이 설명되어 있습니다. >안녕하세요.. >간세포 분리 배양법에서 seglen의 방법과 berry friend의 방법이 >많이 쓰이든데..어떻게 하는건가요. 일반적으로 많이 알려진 방법인가요? >전 구체적인 method를 알고싶은데....직접실험을 해야하는데.. >주변에서 하던것이 아니라 혼자서 공부하고 정립해야하거든요. >도움부탁드립니다..

Berry와 Friend의 방법과 Seglen의 방법이 primary hepatocytes culture방법과 관련하여 가장 많이 인용되는 논문입니다. 그 외 논문들은 앞선 두 방법을 개량한 방법들이 대부분(?)일 겁니다. 그리고 Seglen 방법 또한 Berry의 방법을 개량한 것입니다. 이런 primary hepatocyte isolation 방법을 two-step perfusion method라 합니다. 각설하고 제가 사용하는 방법을 알려드리면 1. 먼저 간문맥(portal vein)에 cannulation을 합니다. 2. 그리고 pH 7.4(또는 7.2)의 pre-perfusion buffer (containing 137mM NaCl, 5.36mM KCl, 0.5mM NaH2PO4, 0.42mM Na2HPO4, 10mM HEPES, 0.5mM EGTA and 5mM glucose)를 약 10분간 흘려 간에서 피를 제거합니다. (피가 모두 제거되면 간이 밀크커피색(?)으로 됩니다) 3. 피를 제거한 간을 조심스럽게 (표면에 상처가 나면 안됨) 떼어냅니다. 4. 그리고 다시 pH 7.4의 collagenase perfusion buffer (containing 137mM NaCl, 5.36mM KCl, 0.5mM, 5mM CaCl2, NaH2PO4, 0.42mM Na2HPO4 10mM HEPES, 0.05% collagenase and 0.005% trypsin inhibitor)을 10분간 흘립니다. 이 때 간세포들이 분리되는 것을 육안으로 확인하실 수 있습니다. 5. 마지막으로 pH 7.4의 washing buffer (containing 137mM NaCl, 5.36mM KCl, 0.5mM NaH2PO4, 1mM MgCl26H2O, 0.8mM MgSO47H2O, 0.42mM Na2HPO4, 10mM HEPES, 0.5mM EGTA and 5mM glucose)에 간을 넣고 조심스럽게 흔들면서 hepatocytes를 분리합니다. 6. 분리한 hepatocytes를 50g X 5분간 원심분리 하고 상층액을 버립니다.(2회 정도 반복) 7. viability를 확인합니다. 지금 직장인 관계로 원문을 연결할 수 없습니다. 필요하시면 연락주세요 그리고 참고문헌 (Berry and Friend, PO Seglan) MN Berry, DS Friend. High-yiely preparation of isolated rat liver parenchymal cells. J. Cell. Biol. 43 : 506-520, 1969. PO Seglen. Preparation of rat liver cells. Ⅰ. Effect of Ca2+ on enzymetic dispersion of isolated perfused liver. Exp. Cell Res. 74 : 450-454, 1972 Hepatocytes review라는 단행본이 있습니다. 이 책은 30년간의 hepatocyte관련 연구를 정리한 책입니다. 전체적인 그림이 안그려 지실 것 같아 모식도(?) 첨부해 봅니다. >안녕하세요.. >간세포 분리 배양법에서 seglen의 방법과 berry friend의 방법이 >많이 쓰이든데..어떻게 하는건가요. 일반적으로 많이 알려진 방법인가요? >전 구체적인 method를 알고싶은데....직접실험을 해야하는데.. >주변에서 하던것이 아니라 혼자서 공부하고 정립해야하거든요. >도움부탁드립니다..

>안녕하세요.. >간세포 분리 배양법에서 seglen의 방법과 berry friend의 방법이 >많이 쓰이든데..어떻게 하는건가요. 일반적으로 많이 알려진 방법인가요? >전 구체적인 method를 알고싶은데....직접실험을 해야하는데.. >주변에서 하던것이 아니라 혼자서 공부하고 정립해야하거든요. >도움부탁드립니다.. 간세포 배양 ① 흰쥐의 간세포는 Berry와 Friend의 방법을 약간 수정한 2단계 collagenase 관 류법을 이용하여 분리 ② 간세포를 얻기 위하여 urethane (1g/kg body weight)으로 마취시키고 70% ethanol로 복부를 소독한 후 개복 ③ 간문맥에 21 gauge catheter를 삽관 (canulation)하고 하대정맥을 잘라 혈액 을 제거 ④ HBSS 150mL를 perfusion 한 후 흉강을 열어 상대정맥에 18 gauge catheter를 삽관한 다음 하대정맥을 묶어서, 소화용액이 상대정맥을 통하여 공급용기로 되돌아오는 재순환이 이루어지도록 함 ⑤ CO2와 O2의 혼합기체를 공급해주면서 HBSS 95mL과 collagenase 5mL (10mg/mL HBSS , final conc. 0.05%)로 구성된 소화용액으로 10분간 재순환 ⑥ 간세포가 소화된 후 간을 떼어내어 HBSS 60mL을 가한 후 간막을 가위로 열어 서 간세포가 유리되게 한 다음 lense paper로 여과 ⑦ 여액을 50에서 4분간 원심분리한 다음 상징액을 버리고, 다시 배양액으로 같 은 조건에서 원심분리한 후 세포 현탁액을 얻음 ⑧ 간세포 현탁액을 5×105 cells/mL 농도로 희석하여 collagen type I으로 미리 도포된 배양 용기 (Falcon, 35×10mm)에 이식 배양액으로는 Waymouth's MB 752/1 medium, 5% fetal bovine serum, 2.0mg/mL bovine serum albumin (fraction V), 10-6M dexamethasone, 10-7M insulin, 5.32 × 10-2M L-serine, 4.09 × 10-2M L-alanine, 2.67 × 10-2M NaHCO3, 100IU/mL penicillin, 100 IU/mL streptomycin, 5㎍/mL amphotericin B 또는 50㎍/mL gentamicin sulfate로 구성된 것을 사용 배양환경 일정한 습도와 온도가 유지되는 37℃ 배양기에서 산소 (95%)와 CO2 (5%)의 혼합기 체를 계속 공급하면서 세포를 배양