2006-04-19
org.kosen.entty.User@400492d7
이현정(endeavor)
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sequencing 결과에 대해 궁금한게 있어 이렇게 글 올립니다.
다름이 아니라 clone을 sequencing 의뢰해서 받아 original sequence과 비교해 본 결과, 역방향으로 읽었을때 base가 하나 틀려서 아미노산이 바뀌는데요, 이럴때 cloning을 꼭 다시 해야하나요??
GAA 라는 original gene sequence가 AAA로 읽혀서 Leu -> Phe로 바뀌었어요. 지금 정확하게 기억이 잘 안나는데 아미노산을 산성, 염기성, 친수성, 소수성... 이렇게 분류할 수 있잖아요.
아미노산이 틀려도 성격상 같은 부류에 속하면 괜찮지 않나요??
한 아미노산이 틀려지더라도 단백질 구조에 큰 영향을 미치나요??
아잉~ 어떡해... 다시 cloning을 하는게 현명한 방법일까요?
그리고 하나 더....
sequencing을 의뢰시 vector primer가 아닌 insert를 PCR할때 사용했던 primer로 읽었을 경우 몇 bp부터 정확하게 읽히나요?
의뢰한게 여러개 되는데 대부분 10-20bp 이후부터 정확하게 읽는 것 같더라구요.... 그리고 어떤 건 30bp 이후부터 정확하구요.
이럴때 10-20bp 사이의 match가 안되는 sequence는 무시해도 되는 건지 궁금합니다. cloning 해야할 gene이 아직도 많이 남았는데 정말 답답하기 그지 없어요~~!!
빠른 답변 부탁드립니다. 정말 속 시원한 대답을 듣고 싶어요~~~!!!!
그럼 즐건 하루 보내세요~~!!
- sequencing
- sequencing analysis
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답변 2
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답변
이주미님의 답변
2006-04-20- 0
일단, 시퀀싱을 의뢰 하셨다니, 시퀀싱 의뢰기관에서 주는 크로마토그램 (시퀀싱 peaks를 보여주는) 을 차분하게 확인해 보시기 바랍니다. 그 peak에서도 확실한 bp를 보여준다면, 클로닝을 다시하여야 하실 겁니다. 저의 경험으로는 시퀀싱할 당시 실험의 변수가 조금씩 있으므로, 아무리 짧은 insert라 할지라도 양방향으로 모두 읽어 주셨는지, 아니면 두세번 시퀀싱을 의뢰하시고 확인해주시는 것도 좋은 방법입니다. mutation이 없는 정확한 clone을 얻기위해서는 정확한 검증을 클로닝 부터 시퀀싱 과정까지 하셔야 하니까요. 그리고 제가 알기로는 프라이머 하나당 최소한 3-400 bp는 거뜬히 읽어 내는 것으로 알고 있습니다. 그래도 시퀀싱 하실때 약간은 overlap되게 시퀀싱 프라이머를 design하심이 좋을듯 싶네요. 클로닝이 그래서 힘들다고 하죠. 건승을 빕니다. >sequencing 결과에 대해 궁금한게 있어 이렇게 글 올립니다. >다름이 아니라 clone을 sequencing 의뢰해서 받아 original sequence과 비교해 본 결과, 역방향으로 읽었을때 base가 하나 틀려서 아미노산이 바뀌는데요, 이럴때 cloning을 꼭 다시 해야하나요?? >GAA 라는 original gene sequence가 AAA로 읽혀서 Leu -> Phe로 바뀌었어요. 지금 정확하게 기억이 잘 안나는데 아미노산을 산성, 염기성, 친수성, 소수성... 이렇게 분류할 수 있잖아요. >아미노산이 틀려도 성격상 같은 부류에 속하면 괜찮지 않나요?? >한 아미노산이 틀려지더라도 단백질 구조에 큰 영향을 미치나요?? >아잉~ 어떡해... 다시 cloning을 하는게 현명한 방법일까요? > >그리고 하나 더.... >sequencing을 의뢰시 vector primer가 아닌 insert를 PCR할때 사용했던 primer로 읽었을 경우 몇 bp부터 정확하게 읽히나요? >의뢰한게 여러개 되는데 대부분 10-20bp 이후부터 정확하게 읽는 것 같더라구요.... 그리고 어떤 건 30bp 이후부터 정확하구요. >이럴때 10-20bp 사이의 match가 안되는 sequence는 무시해도 되는 건지 궁금합니다. cloning 해야할 gene이 아직도 많이 남았는데 정말 답답하기 그지 없어요~~!! >빠른 답변 부탁드립니다. 정말 속 시원한 대답을 듣고 싶어요~~~!!!! > >그럼 즐건 하루 보내세요~~!! -
답변
정철웅님의 답변
2006-04-20- 0
윗분이 말씀하신 것처럼 분석 그래프를 보고 꼭 확인 해야 합니다. 특히 GAA처럼 되어 있는 경우 G가 A의 노이즈에 묻혀서 AAA로 읽힐 수 도 있습니다. 별도로 궁금 한 것은 클로닝을 라이브러리에서 PCR 했는지 아니면 cDNA에서 했는지에 따라 mutation일 수도 있고, polymorphism일 수도 있습니다. 한 개의 아미노산이 바뀜으로 해서 단백질의 구조가 바뀔 수도 있고 구조가 바뀌어도 기능은 안 바뀔 수도 있습니다. 나중에 직접 실험 해 보는 수 밖에 없습니다. 잘 기록 해 두었다가 control로 사용 할 수도 있으니 돌연변이 생긴 클론이라고 해도 버리지 마시기 바랍니다.