KOSEN 한인과학기술자네트워크

>human chromosomal DNA에 bisulfite를 처리한 후 정제하여 PCR을 하였는데 band가 너무 연하게 나왔습니다. 1st PCR(cycle 30)한 후에 nested PCR하였반응50ul중에서 10ul를 loading했지만 너무 연하게 나와서 사진을 찍으면 밴드가 확인이 안될정도였습니다. 그치만 논문을 보면 PCR후의 밴드가 상당히 선명하게 보이는데 어떻게 하면 그렇게 선명한 밴드를 볼 수 있을까요? 저는 2%agarose를 사용하였습니다. --> 2%agarose 가 중요한 것은 아니죠. 논문과 같은 gene에 같은 primer를 사용하셨나요? 온도 조건은요?일단 가지고 계신 프라이머의 디자인을 다시한번 검토해보시길 바랍니다. 또한 PCR 조건도 다르게 사용하시고요. Polymerase를 어디 것을 사용하셧는지 모르지만 salt 농도에 따라서 yield가 다르게 나올 수 있으니 참조하시기 바랍니다. kit설명서를 보시면 어떻게 바꿔야 할지 감이 잡히실 것입니다. > 그리고 MSP후 sequence를 의뢰했는데 원하는 sequence는 20번인데 엉뚱하게도 5번의 sequence가 들어가 있었습니다. 사용한 벡터는 pGEM T-vector(promega)입니다. ---> 도데체 무슨 말인지 모르겠네요. 답을 원하시면 더 상세한 설명을 부탁드립니다. >5aza2' deoxycytidine을 cell에 20uM정도 처리하여 3일동안키웠는데 처리하지 않은 cell에서의 원하는 단백질 발현과 차이가 거의 없었습니다. 다른 논문에서는 5uM이나 10uM정도를 처리하여 4일정도 키웠는데도 결과가 잘나온것같습니다. 혹시 5aza의 농도가 너무 높은면 제대로 작용을 하지 않나요? --> 같은 셀라인인가요? 왜 더 높게 처리하셨죠? 항체는 같은 것인가요? 샘플 loading은 같은 양인가요?(시그날이 saturation되면 차이를 보기 힘들 수 있습니다) 일단은 같은 결과를 보시고 싶으면 똑같이 반복하셔야 하구요, 새로운 셀라인에 하실때는 적정 농도를 잡으셔야 합니다. 20, 10, 5, 2, 1, 0.5 , 0 uM 로 처리하여서 (1),2,3,4,(5)일 후에 샘플링하셔 보기 바랍니다. 1개의 농도로 1개의 시간대만 실험 한 것 가지고는 아무것도 알 수 없습니다. 어떤 drug이던 높은 농도가 이로운 것은 거의 없습니다. 평소 보다 높은 농도를 처리할 때는 더 세심한 관찰이 필요합니다. 죽은 세포가 증가했나? 세포 형태는 큰 변화가 없나? 이 두개만 관찰 잘해도 signal transduction에서 접근할 수 있는 방법이 넘쳐 납니다. 시간대별로 사진 찍어 놓으면 나중에 꼭 필요합니다. 전체적으로 실험 디자인 할 때부터 경험자의 도움이 필요하다는 느낌입니다. advisor를 적극활용하시기 바랍니다. 그 사람들은 그 때 이용하라고 돈 받는 것이니까요.