2006-05-05
org.kosen.entty.User@69961452
이현정(endeavor)
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궁금한게 있어 이렇게 글 남깁니다.
제가 Yeast two hybrid 실험을 하는데요,
library screening하기 전에 bait의 autonomous activity를 체크하잖아요
x-gal assay로 확인해봤더니 Autonomous activity를 나타내더라구요.
근데 아미노산 서열로 domain search를 통해 확인한 결과, activation domain이 없더라구요,
이럴때는 어떻게 해야하나요? activation domain이 있으면 그 부분을 잘라내 deletion mutant로 screening을 하면 된다고 하지만 activation domain이 없는데도 불구하고 activity를 나타내는데 어떡하나요?
아예 screening을 진행할 수 없는 gene인가요?
궁금합니다.
빠른 답변 부탁드릴게요~~~!! 그럼 즐건 주말 보내세요~~~
- Yeast two hybrid
- autonomous activity
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답변 1
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답변
정철웅님의 답변
2006-05-08- 0
>궁금한게 있어 이렇게 글 남깁니다. >제가 Yeast two hybrid 실험을 하는데요, >library screening하기 전에 bait의 체크하잖아요 >x-gal assay로 확인해봤더니 Autonomous activity를 나타내더라구요. >근데 아미노산 서열로 domain search를 통해 확인한 결과, activation domain이 없더라구요, >이럴때는 어떻게 해야하나요? activation domain이 있으면 그 부분을 잘라내 deletion mutant로 screening을 하면 된다고 하지만 activation domain이 없는데도 불구하고 activity를 나타내는데 어떡하나요? >아예 screening을 진행할 수 없는 gene인가요? >궁금합니다. >빠른 답변 부탁드릴게요~~~!! 그럼 즐건 주말 보내세요~~~ 뭐 특별한 방법은 없습니다. 단지 님의 유전자를 몇군데 도메인 별로 잘라서 construct를 만드신 다음 Autonomous activity가 없기를 바래야지요. 돌아가는 방법으로서는 Immunoprecipitation을 이용한 방법이 있습니다. 님의 유전자의 flag tag같은 것을 붙이신 다음 세포에 과발현 후 IP 해서 같이 떨어진 단백질을 proteomics를 이용해 분석하실 수 도 있습니다. 비슷한 방법으로는 박테리아에서 단백질 정제후 특정 티슈의 lysate와 binding 후 Immunoprecipitation 또는 GST-bead down 등을 통해 interaction 하는 단백질을 동정할 수 도 있습니다. 어차피 yeast-two hybrid해서 나온 단백질과 in vitro & in vivo binding confirm을 해야하니 도메인 별로 잘라서 construct를 만드시면서 tag을 이용한 어새이도 병행해보시기 바랍니다.