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2006-06-02 org.kosen.entty.User@290add69 권정은(clssy77)
  • 3
음.. 지금 살짝 더위 먹기 직전입니다... 제가 클로닝한 유전자(1)가 세포내에서 잘 발현된다는 것을 확인하였습니다.사이즈도 맞구요... 그런데 나중에 그것을 NCBI에 SUBMIT 된 시퀸스와 얼라인해보니 엄청난 숫자의 돌연변이와 심지어 DELETION까지 되어 있더군요~! 그래서 KUGI에서 구입하였는데...(2) 애초보다 심하지는 않지만 (1)보다 약 1/3 정도 숫자의 돌연변이, 그리고 역시 deletion되어 있어서 걍 RT-PCR을 해서 다시 클로닝하기로 마음 먹었습니다. RT-PCR 후 클로닝하고 두개의 클론의 선택해 시퀸싱을 보내고 발현 테스트를 해보았습니다.....(A) and (B) 근데 (A)번을 시퀸스를 확인해보니 NCBI 와 아미노산 44개가 주루룩 다른 거에요..DELETION도 아니고, (A)는 고스란히 다르느 44개의 아미노산으로 바뀌어 있었고 대부분 GGA가 CCT로 바뀌면서 생긴일이었습니다. 이상해서 human genom project와 align해보니..(A) 가 맞더군요! 그래서 자신있게 발현되리라 생각햇는데... (A)는 안되고 (B)가 사이즈 맞게 발현되는 것이었습니다...ㅠ.ㅠ 당연히 시퀸스도 맞으리라 생각하고 확인해봤더니...왠걸... (1),(2)와 마찬가지로 deletion, mutation... A는 보니까 앞에 시퀸스가 하나 빠졌더라구요..프레임시프트(한국어로 하니까 이상하네요) taq이라 그렇다고 하기에는 너무 엄청난 돌연변이였습니다. deletion도 이해가 되지 않구요... (A),(B)를 클로닝할때는 pfu를 사용했습니다. 그런데 A와 B가 너무도 다른 시퀸스인겁니다.. 그래서 지금 생각에 이 mutant들이 모두 PCR 에러인 것 같지는 않다는 겁니다. 지금 상황이... 서로 다른 POOL에서 얻은 같은 유전자들이 너무도 다르고.. 심지어 같이 RT를 한 것도... Splicing 이라고 하기에는 시퀸스가 하나하나 너무도 정교하게(?) mutation 되어있고..... 혹시 이 유전자가 여러 카피가 있는 건 아닌지...확인할 길이 없습니다. splicing도 아니고... 그럼 저는... 걍 genom project에 올라와 잇는 A 유전자를 앞에 시퀸스 하나 빠진거 넣어서 사용해야할까요.. 아니면 발현이 잘되는 B나 다른 걸 사용하면 안되는 걸까요?? 그렇게 돌연변이가 많고 소규모 deletion 도 잇는데 멀쩡한 사이즈에서 발현된다는 것도 이해가 안 갑니다... ㅠ.ㅠ 그래서 모두 정상적인 유전자가 아닌가..라는 생각이 들어요. 이거 어떻게 확인해야 되나요.. 이 유전자때문에 한달 넘에 '놀고'있습니다. endogenous 실험도 한계가 있네요... ㅠ.ㅠ.ㅠ.ㅠ.ㅠ.ㅠ 어떻게 생각하세요..무얼 사용해야 하나요...
  • seqence
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답변 3
  • 답변

    김은민님의 답변

    2006-06-02
    • 0
    안녕하세요? ㅋㅋ 유전자때문에 많이 애를 먹고 계신것같습니다. 우선...이 말씀을 드려야할 것같습니다. NCBI에 밝혀진 유전자의 sequence가 100% 맞다고 생각하시면 안됩니다. human인지 mouse인지는 잘 모르겠지만요. 저도 님과 같은 경험을 했었답니다. 어떤 마우스의 원인 유전자를 찾기위해 가장 유력한 유전자를 선별해서, sscDNA를 합성하고, 유력 원인유전자의 primer를 합성하여 PCR후에 sequencing을 한 적이 있었습니다 (이것을 mutation analysis라고들 하지요. 여러 방법들이 있지만, 저는 direct sequencing으로 확인했습니다.) 그런데.. 64개의 nucleotide의 mutation이 detection되는 것이 아니겠습니까? 님처럼 몇번 시도해보다가, 저는 이렇게 확인했습니다. 제가 mutation analysis를 하기위해 준비한 sscDNA는 비정상마우스에서 유래한 것이었답니다. 그래서, 정상마우스 (black6)의 sscDNA를 함께 준비해서 동일한 방법으로 sequencing한결과!! 동일하게 63개의 nucleotide mutation이 detection되었고, 하나의 nucleotide만이 다른 것이었습니다. 그래서 결론을 내린것은, NCBI의 squence가 strain의 차이가 아니라, data base에 update 할 때 잘못된 sequence를 올렸던 것이었습니다. 나중에 (2년후) 다시 NCBI에 들어가서 확인해보았더니, 제가 분석한 결과가 맞더라구요~ 다시 수정해서 올려놓았더군요. 이처럼 정확하다고 믿는 정보가 틀릴수도 있다는 사실을..아셨으면 좋겠습니다. novel gene이라면 그 정보가 틀릴 가능성이 더 크죠..novel gene이 아니라면, clone을 구입하는 것이 가장 정확하답니다.. 님께서 저처럼 정상 마우스와 비정상마우스를 비교할수 없는 상황이시고,그 mutation 된부분이 항상 동일하다면...결과를 믿으세요!!그리고 앞으로 전진하세요. 그리고!! 가장 기본적으로, 님께서 사용하신 primer pair가 님의 유전자를 증폭하기에 정말 적합한 primer 쌍인지, 반드시 확인하시기 바랍니다. A와 B가 전혀 다른 clone이라면, primer pair가 specific하지 않다는 것이니까요..혹시 pseudo gene은 아닌가요? 직접 discussion하면 좋을텐데요..쩝!! 제가 알고있는 정보를 글로 쓰는 것만큼 어려운것이 없더라구요^^ ㅋ 어렵습니다!!! 이번 PLS 모임때 뵐수 있나욤?? 도움이 되셨으면 좋겠습니다!!
    답변수정
    안녕하세요? ㅋㅋ 유전자때문에 많이 애를 먹고 계신것같습니다. 우선...이 말씀을 드려야할 것같습니다. NCBI에 밝혀진 유전자의 sequence가 100% 맞다고 생각하시면 안됩니다. human인지 mouse인지는 잘 모르겠지만요. 저도 님과 같은 경험을 했었답니다. 어떤 마우스의 원인 유전자를 찾기위해 가장 유력한 유전자를 선별해서, sscDNA를 합성하고, 유력 원인유전자의 primer를 합성하여 PCR후에 sequencing을 한 적이 있었습니다 (이것을 mutation analysis라고들 하지요. 여러 방법들이 있지만, 저는 direct sequencing으로 확인했습니다.) 그런데.. 64개의 nucleotide의 mutation이 detection되는 것이 아니겠습니까? 님처럼 몇번 시도해보다가, 저는 이렇게 확인했습니다. 제가 mutation analysis를 하기위해 준비한 sscDNA는 비정상마우스에서 유래한 것이었답니다. 그래서, 정상마우스 (black6)의 sscDNA를 함께 준비해서 동일한 방법으로 sequencing한결과!! 동일하게 63개의 nucleotide mutation이 detection되었고, 하나의 nucleotide만이 다른 것이었습니다. 그래서 결론을 내린것은, NCBI의 squence가 strain의 차이가 아니라, data base에 update 할 때 잘못된 sequence를 올렸던 것이었습니다. 나중에 (2년후) 다시 NCBI에 들어가서 확인해보았더니, 제가 분석한 결과가 맞더라구요~ 다시 수정해서 올려놓았더군요. 이처럼 정확하다고 믿는 정보가 틀릴수도 있다는 사실을..아셨으면 좋겠습니다. novel gene이라면 그 정보가 틀릴 가능성이 더 크죠..novel gene이 아니라면, clone을 구입하는 것이 가장 정확하답니다.. 님께서 저처럼 정상 마우스와 비정상마우스를 비교할수 없는 상황이시고,그 mutation 된부분이 항상 동일하다면...결과를 믿으세요!!그리고 앞으로 전진하세요. 그리고!! 가장 기본적으로, 님께서 사용하신 primer pair가 님의 유전자를 증폭하기에 정말 적합한 primer 쌍인지, 반드시 확인하시기 바랍니다. A와 B가 전혀 다른 clone이라면, primer pair가 specific하지 않다는 것이니까요..혹시 pseudo gene은 아닌가요? 직접 discussion하면 좋을텐데요..쩝!! 제가 알고있는 정보를 글로 쓰는 것만큼 어려운것이 없더라구요^^ ㅋ 어렵습니다!!! 이번 PLS 모임때 뵐수 있나욤?? 도움이 되셨으면 좋겠습니다!!
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  • 답변

    권정은님의 답변

    2006-06-02
    • 0
    답변해주셔서 고맙습니다.. 저 역시 유전자들의 source를 생각해봤답니다 KUGI 것은 분명...cancer에서 얻어낸 것이었고... 제가 한 RT-PCR도 역시 HeLa cell... 분명 제 유전자가 mutation이 되어잇을 가능성도 있겟지요. 그런데 RT 가 문제입니다. 같은 cell line에서 같이 prep하고 RT 하고 클로닝 한 것입니다. 단지 transformation 한 plate에서 다른 대장균 클론을 두개 선택한 것 뿐이지요... 에게 완전히 다른 유전자라면 차라리 좋겠습니다. NCBI에 돌려보면 같은 유전자가 뜹니다...그것도 같은 ACCESSION (?) 번호루요... 단지... A번은 앞에 G 하나 빠지거(참 운도 없지요..멀쩡한 프라이머인데, 사실 이것도 이해가 안 갑니다. 프라이머부분으로 amplify 도ㅐㅆ을껀데~!) B는 많은 mutation과 deletion을 가？병募？거... 그럼 혹시 chromosome상의 두 copy 중에서 하나가 엉망인 걸까요? 그게 하필이면 발현도 잘되고...? 아우...ㅠ.ㅠ 암튼... human genom project 상의 유전자를 믿어야하겟지만..서두... 걍.. G가 하나 빠졌지만 멀쩡한 유전자를 건지긴 햇다는 걸로(그 많은 mutation 경쟁을 뚫고) 만족하기로 햇는데..(ㅎㅎ 제가 다시 mutation 시켜야겠네요) 이 유전자 apoptosis에 관련된 건데, 그래서 그런가 ㅡ.ㅡ; 어쩌면 cancer마다 이 유전자가 다 이상할지도 모릅니다~!! 암튼...지금으로서는 genom project에 맞추고 다른 cell line에서 계속 rt 확인을 해야겠요 아 근데 PLS가 모임이름인가요? ㅠ.ㅠ 다른 소규모 모임인가요? 25일 모임에 가고싶은데 지방이라 혼자 가기가 망성여지네요~ 서울이시면 저랑 같이 가시면 좋은데^^
    답변수정
    답변해주셔서 고맙습니다.. 저 역시 유전자들의 source를 생각해봤답니다 KUGI 것은 분명...cancer에서 얻어낸 것이었고... 제가 한 RT-PCR도 역시 HeLa cell... 분명 제 유전자가 mutation이 되어잇을 가능성도 있겟지요. 그런데 RT 가 문제입니다. 같은 cell line에서 같이 prep하고 RT 하고 클로닝 한 것입니다. 단지 transformation 한 plate에서 다른 대장균 클론을 두개 선택한 것 뿐이지요... 에게 완전히 다른 유전자라면 차라리 좋겠습니다. NCBI에 돌려보면 같은 유전자가 뜹니다...그것도 같은 ACCESSION (?) 번호루요... 단지... A번은 앞에 G 하나 빠지거(참 운도 없지요..멀쩡한 프라이머인데, 사실 이것도 이해가 안 갑니다. 프라이머부분으로 amplify 도ㅐㅆ을껀데~!) B는 많은 mutation과 deletion을 가？병募？거... 그럼 혹시 chromosome상의 두 copy 중에서 하나가 엉망인 걸까요? 그게 하필이면 발현도 잘되고...? 아우...ㅠ.ㅠ 암튼... human genom project 상의 유전자를 믿어야하겟지만..서두... 걍.. G가 하나 빠졌지만 멀쩡한 유전자를 건지긴 햇다는 걸로(그 많은 mutation 경쟁을 뚫고) 만족하기로 햇는데..(ㅎㅎ 제가 다시 mutation 시켜야겠네요) 이 유전자 apoptosis에 관련된 건데, 그래서 그런가 ㅡ.ㅡ; 어쩌면 cancer마다 이 유전자가 다 이상할지도 모릅니다~!! 암튼...지금으로서는 genom project에 맞추고 다른 cell line에서 계속 rt 확인을 해야겠요 아 근데 PLS가 모임이름인가요? ㅠ.ㅠ 다른 소규모 모임인가요? 25일 모임에 가고싶은데 지방이라 혼자 가기가 망성여지네요~ 서울이시면 저랑 같이 가시면 좋은데^^
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  • 답변

    김은민님의 답변

    2006-06-03
    • 0
    어떤것을 보려하는지, 무엇을 원하는지를 고민하시고.. 지금처럼 열의를 가지고 열심히하세요~~*^^*~~저도 열심히 해야지요~ products의 사용결정은 다른 누구보다 지도교수님과 상의 후 진행하셔야 할 듯합니다*^^* 가끔은.. 열심히는 했는데, 다시해야하는 상황이 오기도 하니까요*^^* 아자아자!! 화이팅입니다. 앗 그리고 저는 서울에서 출발합니다. PLS는 people of Life Science의 약자로 의생명과학이나 기초과학을 하는 이들의 소모임이랍니다.(알고계시면서 질문하신거죠?ㅋㅋㅋ) 25일에 뵐수있었으면 좋겠습니다. 만나자마자 어색하지 않은 마법같은 일이 벌어질것입니다!! *^^* 좋은 주말되세요!!
    답변수정
    어떤것을 보려하는지, 무엇을 원하는지를 고민하시고.. 지금처럼 열의를 가지고 열심히하세요~~*^^*~~저도 열심히 해야지요~ products의 사용결정은 다른 누구보다 지도교수님과 상의 후 진행하셔야 할 듯합니다*^^* 가끔은.. 열심히는 했는데, 다시해야하는 상황이 오기도 하니까요*^^* 아자아자!! 화이팅입니다. 앗 그리고 저는 서울에서 출발합니다. PLS는 people of Life Science의 약자로 의생명과학이나 기초과학을 하는 이들의 소모임이랍니다.(알고계시면서 질문하신거죠?ㅋㅋㅋ) 25일에 뵐수있었으면 좋겠습니다. 만나자마자 어색하지 않은 마법같은 일이 벌어질것입니다!! *^^* 좋은 주말되세요!!
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