2006-06-07
org.kosen.entty.User@179f69d9
민준기(mck333)
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GST tagging 된 gene을 cloning 해서 IPTG induction을 하려고 하는데
조건을 아무리 바꿔봐도 induction이 되지 않습니다.
분명히 sequencing을 해서 cloning을 확인도 해보았는데 induction이 안되네요
그래서 여러 cell에서 induction 해본다고 BL21, DH5a, XL1Blue 에서 IPTG induction도 해보았고, IPTG농도도 바꿔보았는데도 induction이 되지 않습니다.
expression된 protein profiles를 비교해보았을때 cloning 된 gene이 expression은 되는거 같은데 IPTG induction 한것과 안한것을 비교해 보았을때 발현양에 있어서는 별다른 차이가 없습니다.
여러 선생님들의 조언 부탁드립니다.
- IPTG induction
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
노갑수님의 답변
2006-06-08- 0
>GST tagging 된 gene을 cloning 해서 IPTG induction을 하려고 하는데 >조건을 아무리 바꿔봐도 induction이 되지 않습니다. >분명히 sequencing을 해서 cloning을 확인도 해보았는데 induction이 안되네요 >그래서 여러 cell에서 induction 해본다고 BL21, DH5a, XL1Blue 에서 IPTG induction도 해보았고, IPTG농도도 바꿔보았는데도 induction이 되지 않습니다. >expression된 protein profiles를 비교해보았을때 cloning 된 gene이 expression은 되는거 같은데 IPTG induction 한것과 안한것을 비교해 보았을때 발현양에 있어서는 별다른 차이가 없습니다. > >여러 선생님들의 조언 부탁드립니다. > lac promoter 유래 프로모터를 가진 플라스미드 쓴 것 맞나요? lac promoter유래 프로모터라도 해도 경우에 따라서 (프로모터의 종류나 클로닝된 유전자) strict하게 control이 안되는 경우도 있습니다. 혹시 IPTG 오래된 것은 아닌지도 체크해보시기 바랍니다. -
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김은민님의 답변
2006-06-08- 0
induction 해야하는 단백질이.. 꼭 GST fusion이어야만 하나요? 님께서 원하시는 단백질이 유전자 전체를 단백질로 encode하는 부분인가요? induction이라고 하는 것은 그 단백질의 hydrophilicity와 연관이 있어서, hydropilic한 단백질일수록 GST induction 시 inclusion body가 아닌 soluble fraction에서 induction이 되는 것으로 알고 있습니다. 님께선 induction한 후 supernatant부분만을 취해서 G bead로 purify하셨을 것이라 생각됩니다. inclusion body로 떨어졌을 가능성도 배재 하실수는 없지요. induction이 잘 안될때, Tagging을 바꿔보는 방법으로 진행하는 것이 좋을 것같습니다. 경험상 GST induction 잘 안되는 단백질이 ㄱㅏ끔은 His tagging induction이 되는 경우도 있으니까요... 꼭 GST tagging을 해야한다면, 유전자의 hydropilic한 부분을 이용하여 induction 해보세요*^^* 단백질을 조각내면 안되는 경우에는 어쩔수 없지만요.. 더 궁금한 점이 있으면 연락주십시요*^^* 건승하세용!! -
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전주홍님의 답변
2006-06-08- 0
Coomassie staining으로만 확인하셨는지요? Induction이 잘 안되는 경우에는 staining만으로 관찰하기 힘들 때가 있습니다. Western blot으로 induction 여부를 한번 확인하시길 바랍니다. 물론 in-frame은 확실하겠죠? >GST tagging 된 gene을 cloning 해서 IPTG induction을 하려고 하는데 >조건을 아무리 바꿔봐도 induction이 되지 않습니다. >분명히 sequencing을 해서 cloning을 확인도 해보았는데 induction이 안되네요 >그래서 여러 cell에서 induction 해본다고 BL21, DH5a, XL1Blue 에서 IPTG induction도 해보았고, IPTG농도도 바꿔보았는데도 induction이 되지 않습니다. >expression된 protein profiles를 비교해보았을때 cloning 된 gene이 expression은 되는거 같은데 IPTG induction 한것과 안한것을 비교해 보았을때 발현양에 있어서는 별다른 차이가 없습니다. > >여러 선생님들의 조언 부탁드립니다. >