2006-06-23
org.kosen.entty.User@567f8170
황래정(skylake2)
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요즘 zymography때문에 스트레스 엄청받고 있습니다.
우선 mammalian cell과 mouse cell에 cytokine을 처리했을때의 MMP-9의
양적인 비교를 하기 위함인데요,
60mm dish에 cell seed후,
24시간 serum starvation 하고,
4개의 plate에 control, 100pg/ml, 1ng/ml, 10ng/ml 이렇게 처리를 하고,
각각의 plate에서 각각 1일, 2일, 3일에 media를 회수하고, 다시 같은 농도로 처리를 하고있습니다.
그런데, 문제는 protein의 양이 너무 모자란것 같습니다.
현재, 농축을 하기 위해서 micro-centricon으로 50KD cut-off하고,
brad-ford로 농도를 측정하면 total protein의 농도가 5ug/100ul 밖에 나오지 않습니다.
1. 이정도의 양으로는 zymography에서 MMP-9의 활성을 보기가 힘든가요?
2. 농축하는데, 문제가 있는것인지?
3. cell은 CCD986SK, NIH3T3 cell line을 가지고 실험을 하는데요, 약, 50%정도로 seed한후 실험을 진행하는데, cell의 수가 적은것인지..?
4. 현재 mouse cell line에서 약, 70kDa쯤에서의 band가 나오긴 했는데, 이건 mmp-2의 band인가요?
5. pre-stained Marker를 사용했는데, 이것의 size가 맞지 않다고하는 얘기를 들은것 같은데, Marker를 바꿔 보는게 의미가 있을까요??
너무 궁금한것이 많고, 답답합니다.
zymo에 대해 실험을 하신 분들의 Know-how를 듣고 싶습니다...
도와 주세요~~~
미리 감사드립니다......ㅡㅡ;;
- zymography
- mmp-9
- mmp-2
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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