2006-06-29
org.kosen.entty.User@b16e3bf
김은경(reiauska)
- 3
안녕하세요. PCR을 하려고 하는데요 1st PCR에 사용하는 primer의 Tm이 68.9도와 69.3도 인데요.
1st PCR
initial denatiration : 95도, 3분,1cycle
cycle 30
denaturation : 95도, 1분
annealing : 69.1도 30초
extension : 72도, 1분
final extension : 72도, 10분, 1cycle
그 후 4도씨에서 식힘..
product size : 720bp
이런 cycle로 PCR을 했는데요,(반응 vol.은 80ul) 전혀 PCR이 되지 않은 것같아요..
위의 PCR product로 nested PCR을 하면 primer만 진하게 보이거든요.
nested PCR condition
(nested PCR primer Tm : 64도, 62.7도
1 cycle : initial denaturation : 95도, 1분
30 cycle
denaturation : 95도, 1분
annealing : 63.3 도 30초
extension : 72도, 1분
1cycle : final extension : 72도 10분
4도, 무한대 보관
product size : 373bp
어떻게 PCR조건을 바꾸면 좋을까요?
genomic DNA에서 원하는 부분만 증폭시킬려하거든요.
부디 꼭 도와주십시오. 감사합니다.
- PCR
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 3
-
답변
정철웅님의 답변
2006-06-29- 0
primer Tm에서 10 도를 빼서 해봅니다. 그래서 잡 밴드 많이 나오면 5도 단위로 올려 보는데요, 한번 해보시기 바랍니다. 대략 50도에서 해도 될 것 같긴 한데... 정 안되면 2 temperature cycle을 돌리시는 것도... denaturation : 95도, 1분 annealing and extension : 68~ 72도, 1분 >안녕하세요. PCR을 하려고 하는데요 1st PCR에 사용하는 primer의 Tm이 68.9도와 69.3도 인데요. >1st PCR >initial denatiration : 95도, 3분,1cycle > >cycle 30 >denaturation : 95도, 1분 >annealing : 69.1도 30초 >extension : 72도, 1분 > >final extension : 72도, 10분, 1cycle > >그 후 4도씨에서 식힘.. > product size : 720bp > >이런 cycle로 PCR을 했는데요,(반응 vol.은 80ul) 전혀 PCR이 되지 않은 것같아요.. > >위의 PCR product로 nested PCR을 하면 primer만 진하게 보이거든요. >nested PCR condition >(nested PCR primer Tm : 64도, 62.7도 >1 cycle : initial denaturation : 95도, 1분 > >30 cycle >denaturation : 95도, 1분 >annealing : 63.3 도 30초 >extension : 72도, 1분 > >1cycle : final extension : 72도 10분 > >4도, 무한대 보관 >product size : 373bp > >어떻게 PCR조건을 바꾸면 좋을까요? >genomic DNA에서 원하는 부분만 증폭시킬려하거든요. >부디 꼭 도와주십시오. 감사합니다. > -
답변
김기윤님의 답변
2006-07-01- 0
PCR이 안된다니 참 답답하시겠네요. 그게 되야 다른것을 계속 진행할텐데... 또 더 높거나 낮다고 해서 PCR이 안되는 건 아닌데요, 일반적으로 primer Tm값보다 5도 정도 낮춰서 annealing을 합니다. 일단 해보고 band pattern을 보고 protocol을 바꿔 보시는게 좋을 듯 싶네요. 그리고, 1st PCR에서 rxn volume을 80까지 할 필요가 있을까요? 일단 1st PCR band를 확인하고 2nd으로 들어가시는게 시간을 아끼는 방법이겠죠. 그리고 소량만 있어도 2nd PCR을 할 수 있으니까 20ul정도만 해도 되지 않을까요?. genomic DNA를 증폭한다고 하는데, promoter 부위인가요? 저두 일전에 genomic DNA에서 특정 promoter를 PCR을 하는데, 계속 target band가 안뜨더라구요. 무지 지저분하게만 나왔는데 (Taq을 썼음), 이 문제는 pfu polymerase를 써서 해결됐습니다. 문제는 band size가 안 맞는건데, 이건 denature 온도를 94도에서 98도로 올리니까 해결되더라구요. 제가 target했던 promoter에 GC함량이 꽤 높았거든요. 일부분은 거의 90% 정도가 GC일정도로.. 이상이 제가 드릴수 있는 tip인거 같네요. 저도 여기까지 해결하는데 6개월이 걸렸습니다. 그럼, 수고하세요. >안녕하세요. PCR을 하려고 하는데요 1st PCR에 사용하는 primer의 Tm이 68.9도와 69.3도 인데요. >1st PCR >initial denatiration : 95도, 3분,1cycle > >cycle 30 >denaturation : 95도, 1분 >annealing : 69.1도 30초 >extension : 72도, 1분 > >final extension : 72도, 10분, 1cycle > >그 후 4도씨에서 식힘.. > product size : 720bp > >이런 cycle로 PCR을 했는데요,(반응 vol.은 80ul) 전혀 PCR이 되지 않은 것같아요.. > >위의 PCR product로 nested PCR을 하면 primer만 진하게 보이거든요. >nested PCR condition >(nested PCR primer Tm : 64도, 62.7도 >1 cycle : initial denaturation : 95도, 1분 > >30 cycle >denaturation : 95도, 1분 >annealing : 63.3 도 30초 >extension : 72도, 1분 > >1cycle : final extension : 72도 10분 > >4도, 무한대 보관 >product size : 373bp > >어떻게 PCR조건을 바꾸면 좋을까요? >genomic DNA에서 원하는 부분만 증폭시킬려하거든요. >부디 꼭 도와주십시오. 감사합니다. > -
답변
박윤희님의 답변
2006-07-03- 0
저의 경우에는 primer의 Tm이 70도라 하여도 60도 근처에서 돌리면 잘 나오던데요... 저라면 이 경우에 95도 5분 95도 40초 60도 40초 72도 1분, 30 cycles 72도 10분 4도 무한대... 어떤 분이 말씀 하신 것처럼 nest PCR의 전단계의 목적으로만 이 PCR을 하시는 거라면 80ul보다는 20 혹은 30ul로 하셔도 무방할것 같구요. 만약 이 과정에서 전혀 product가 나오지 않으면, annealing temp에 변화를 주곤 합니다. 57도에서 매 싸이클마다 0.2도씩 증가하는 조건이라든지... 0.2도씩 증가하는 조건등으로... 예전의 경험을 되살려 보면 한조건으로 잡기 힘들때 이런식으로 조건을 바꿔가면서 돌리던지 혹은 step PCR이란 방법을 써도 괜찮더라구요. 얼른 좋은 결과 얻으시길...