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일단은 restriction enzyme의 star activity가 의심이 되는 대목인 것 같습니다. DNA impurity 등 star activity에 관련된 사항을 다시 한번 체크해 보시길 바랍니다. 그리고 굳이 insert를 확인하고 sequencing을 의뢰하실 필요는 없습니다. 그냥 바로 sequencing을 해서 target gene의 sequence를 확보하면 Blast search를 통해 Identification이 되고 in-frame cloning인지 아닌지만 확인되면 1차 screening은 마무리 됩니다. Re-transformation test를 하고 sequencing을 보낼지 sequencing을 하고 난뒤 의미 있는 clone만 가지고 re-transformation test를 할지는 직접 판단하실 문제이죠...물론 re-transformation test시에는 여러가지 control 실험군이 포함 되어야 겠죠.... >안녕하세요. >매번 실험하다 궁금증이 생기면 젤 먼저 여기로 달려 온답니다. >오늘도 역시 실험하다 막혀서 글 남겨요!! > >제가 cDNA library를 이용해서 yeast two hybrid assay를 하는데요, >현재 yeast transformation을 통해 얻은 colony를 prep하여 (yeast DNA prep) 이를 E.coli cell transformation 했습니다. >여기서 얻은 transformant를 prep해서 enzyme cutting을 통해 vector와 insert 사이즈를 확인하려고 하는데 enzyme이 안 먹히는지 agarose gel 상에서 확인해보면 밴드가 다 끌려서 나와요. >size marker가 깨끗하게 나오는 걸 보면 agarose gel이 이상한건 아닌데.. 이상하게 밴드가 전체적으로 쫘악~ 끌려서 나옵니다. >Enzyme buffer나 plasmid DNA Prep시 elution했을때 사용한 물이 contamination 됐었나 해서 물도 바꿔보고 buffer도 새로 바꿔서 해봤는데도 다 똑같은 현상이 일어나요. >enzyme도 여러개로 잘라서 확인해봤는데 역시나 똑같은 결과입니다. >답답해요~~ insert가 확인돼야 sequencing 의뢰하고 target이 무엇인지 분석할텐데 여기서 막히니 다음 단계로 진행을 할 수가 없어요! >왜 그럴까요?? enzyme cutting 문제가 아니라 아예 Yeast screening이 잘못 된 걸까요?? Screening도 몇 번해서 실험해봤는데 역시나 똑같은 문제점으로 인해 실험 진행이 안되고 있습니다. >속시원한 답변을 듣고 싶어요!! >빨리 target 정해서 다음 실험하고 싶은데.... 부탁드립니다. > >그럼 더운 여름... 건강하게 보내시구요... 다시한번 빠른 답변 부탁드릴게요~~!!! >

실험 하신 내용을 보니 star activity는 이미 점검 하신 것 같군요. 제 동료도 옛날에 이런 일이 있었습니다. 1차 미니 프랩한 DNA를 다시 transformation 해서 콜로니를 얻은 후 거기서 얻은 DNA를 가지고 실험 했습니다. 이유는 plasmid가 한 개만 있는 것이 아니였기 때문입니다. 여러 종류가 섞여 있다 보니 끌려 보일 수 도 있습니다. vector primer가 있으면 pcr 해서 인서트 종류를 확인 해보시는 것도 빠른 해결책일 것입니다. 부디 제 경험이 도움이 되셨길 빕니다.