2006-07-28
org.kosen.entty.User@3cd1d845
최서희(ruth98)
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제가 gene 3개를 pET28a에 cloning 시키려고 하는데..
도무지 잘 되질 않습니다.
pET28a를 EcoRI+SalI, EcoRI+HindIII, EcoRI+XhoI으로 잘라서
ligaton 후에 DH5a에 transformation 시켰습니다.
그런데 vector self와 마찬가지로 ligation 한 plate에서도 colony가
뜨질 않아요. -.,-
그래서 kanamycin도 바꿔보고, vector stock도 여러곳에서 받은 후에
해봤는데 결과가 다 똑같이 나옵니다.
한개가 그렇다면 vector에 toxic해서 안된다고 하지만.. 3개가 다 안되는 이유가 뭘까요?
그렇다고 제가 하는 방법이 처음하는 것도 아니고 다른 모든 vector에서는 잘됐는데... 특별히 pET28a에 주의할 것이라도 있나요?
조언 부탁드립니다. (^-^)(_ _)
- pET28a vector
- cloning
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
정철웅님의 답변
2006-07-28- 0
님이 주신 정보만으로는 세세한 조언은 못 드리겠네요. 단지 pET28a가 특별한 것은 없다는 것 밖에는요. PCR 해서 옮기시는 것인지 아니면 다른 벡터에서 옮기시는 것인지요? PCR해서 넣는 것이라면 중간에 T-vector에 넣었다가 옮기시는 것이 좋구요. vector와 insert의 비율은 어떻게 하셨죠? 비율의 변화를 한 번 주시죠. Transformation positive control은 해보셨나요? kanamycin 농도는 얼마로 하셨죠? 너무 세면 아예 안 뜨는 경우가 있어서 전 항상 30으로.... 어？든 정보가 없어서 도움을 드리기 힘드네요 아무쪼록 성공하시길... >제가 gene 3개를 pET28a에 cloning 시키려고 하는데.. > >도무지 잘 되질 않습니다. > >pET28a를 EcoRI+SalI, EcoRI+HindIII, EcoRI+XhoI으로 잘라서 >ligaton 후에 DH5a에 transformation 시켰습니다. > >그런데 vector self와 마찬가지로 ligation 한 plate에서도 colony가 >뜨질 않아요. -.,- > >그래서 kanamycin도 바꿔보고, vector stock도 여러곳에서 받은 후에 >해봤는데 결과가 다 똑같이 나옵니다. > >한개가 그렇다면 vector에 toxic해서 안된다고 하지만.. 3개가 다 안되는 이유가 뭘까요? >그렇다고 제가 하는 방법이 처음하는 것도 아니고 다른 모든 vector에서는 잘됐는데... 특별히 pET28a에 주의할 것이라도 있나요? > >조언 부탁드립니다. (^-^)(_ _)