2006-08-05
org.kosen.entty.User@2bfdb803
이현정(endeavor821)
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안녕하세요.
이번엔 western blot 결과에 대한 질문입니다.
293 Cell에 Transfection해서 cell lysate를 갖고 co-IP를 하는데요,
western을 했을때 밴드가 다 끌려서 나와요.
Cell lysate와 IP 샘플을 같이 로딩해서 비교해보면. IP한 샘플은 heavy chain과 light chain이 깨끗하게 보이는데 IP시 사용했던 cell lysate는 전체가 다 끌려서 시커멓게 보여요.
예전엔 아무 이상 없다가 중간에 제가 버퍼를 바꿔서 했더니 이런 현상이 일어나더라구요, 그래서 새로 만든 버퍼를 사용하지 않고 그전에 사용했던 버퍼로 실험했는데 똑같은 현상이 일어나네요.
뭐가 문젠가요?? 버퍼의 변화가 없는데도 똑같은 문제가 일어났다면 버퍼의 문제가 아닌 것 같은데....
Protein degradtion이 일어난 건가요???
protease inhibitor를 첨가하면 괜찮아질까요??
어떻게 하면 좋을지 모르겠습니다.
그럼 빠른 답변 부탁드려요~~!!!
- western blot
- Immunoprecipitation
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
정철웅님의 답변
2006-08-07- 0
저 같은 경우 핵을 제거하고 샘플을 만들경우 끌리는 현상이 없어졌습니다. 핵 단백질을 연구하시는 것이 아니라면 핵을 제거하고 샘플로딩하시는 것이 좋을 듯 하네요. 안녕하세요. >이번엔 western blot 결과에 대한 질문입니다. > >293 Cell에 Transfection해서 cell lysate를 갖고 co-IP를 하는데요, >western을 했을때 밴드가 다 끌려서 나와요. >Cell lysate와 IP 샘플을 같이 로딩해서 비교해보면. IP한 샘플은 heavy chain과 light chain이 깨끗하게 보이는데 IP시 사용했던 cell lysate는 전체가 다 끌려서 시커멓게 보여요. > >예전엔 아무 이상 없다가 중간에 제가 버퍼를 바꿔서 했더니 이런 현상이 일어나더라구요, 그래서 새로 만든 버퍼를 사용하지 않고 그전에 사용했던 버퍼로 실험했는데 똑같은 현상이 일어나네요. >뭐가 문젠가요?? 버퍼의 변화가 없는데도 똑같은 문제가 일어났다면 버퍼의 문제가 아닌 것 같은데.... >Protein degradtion이 일어난 건가요??? >protease inhibitor를 첨가하면 괜찮아질까요?? > >어떻게 하면 좋을지 모르겠습니다. >그럼 빠른 답변 부탁드려요~~!!! -
답변
허수학님의 답변
2006-08-09- 0
핵 단백질만을 제거해서 끌리는 현상이 없어진다면 좋겠지만 그런과정에서도 단백질 파괴가 일어날수 있으므로 protease inhibitor를 같이 처리 하시는것을 권해드립니다.. 저같은 경우는 이종 단백질을 분리할때에도 그렇게 하고 있습니다.. >안녕하세요. >이번엔 western blot 결과에 대한 질문입니다. > >293 Cell에 Transfection해서 cell lysate를 갖고 co-IP를 하는데요, >western을 했을때 밴드가 다 끌려서 나와요. >Cell lysate와 IP 샘플을 같이 로딩해서 비교해보면. IP한 샘플은 heavy chain과 light chain이 깨끗하게 보이는데 IP시 사용했던 cell lysate는 전체가 다 끌려서 시커멓게 보여요. > >예전엔 아무 이상 없다가 중간에 제가 버퍼를 바꿔서 했더니 이런 현상이 일어나더라구요, 그래서 새로 만든 버퍼를 사용하지 않고 그전에 사용했던 버퍼로 실험했는데 똑같은 현상이 일어나네요. >뭐가 문젠가요?? 버퍼의 변화가 없는데도 똑같은 문제가 일어났다면 버퍼의 문제가 아닌 것 같은데.... >Protein degradtion이 일어난 건가요??? >protease inhibitor를 첨가하면 괜찮아질까요?? > >어떻게 하면 좋을지 모르겠습니다. >그럼 빠른 답변 부탁드려요~~!!!