2006-09-04
org.kosen.entty.User@44a65db0
백유미(undine1213)
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1. 세포를 5×104cells/ml의 농도로 96 black well-plate에 깔고, 24시간 배양한다.(or 4×105cells/ml, 2시간 배양)
2. Capsaicin을 처리한다. (positive control인 apocynin은 500μM이 되도록 처리)
3. DMSO에 녹인 DCFH-DA stock solution을 최종 농도가 50μM이 되도록 HBSS에 섞는다.
4. Pippet으로 plate의 배지를 제거하고 DCFH-DA 용액을 well마다 200μl씩 가한다.
5. Well plate를 foil로 감싸서 잠시 동안 incubation한다.
6. 5~30분 동안은 1분 간격으로, 그 후는 15~30 분 간격으로 extation 488nm, emission 515~545nm에서 측정한다.
이런 순서로 측정을 해봤는데요..
Positive control로는 Apocynin이라는 물질을 처리했습니다..
근데 나중에 수치 나온 것을 그래프로 그려보니 계속 증가하는 거예요..
Positive control인 apocynin은 증가하면 안 되는데...
도대체 무엇이 잘못된 걸까요?? 가르쳐 주세요..
그리고 혹시 DCFH-DA를 처리한 후, Flourometer로 ROS를 측정하신 분이 있으시면, Protocol을 좀 얻을 수 있을까요??
부탁드립니다...
- ROS
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답변 1
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답변
변해미님의 답변
2006-09-04- 0
자세한 프로토콜은 아니지만, 제가 했던 방법을 간략히 말씀드리자면. =================================================================== (1) ROS측정할 세포를 35mm배양접시에 plating한다 (2) 일주일간 약물처리를 한다 (이건 저의 경우입니다.^^;;;) (3) DCFDA를 준비한다 (전 DCFDA stock solution을 HBSS에 희석시켜서 사용했습니다. 빛에 민감하니 어두운 곳에서 희석하시고, 사용하는 EP tube도 갈색을 사용하시는게 좋습니다. 아니면 호일로 싸서 사용하셔도 되구요. 최종농도는 정확히 기억나지 않지만, 님이 사용하셨던 50uM보다는 많이 낮게 사용했습니다.) (4) ROS를 측정할 샘플의 배지를 제거하고 HBSS로 2번 워싱후 HBSS에 희석되어져 있던 DCFDA를 접시에 담고 어두운 곳에서 1분간 로딩한다. (5) 현미경으로 ROS를 측정한다. ( 한 샘플당 무작위로 3군데의 지점을 측정하여, 평균값을 구했습니다. 빠른 시간내에 하는 것이 중요한것 같습니다.) =================================================================== 측정할 샘플이 많으시다면 아이스박스를 준비하시고, ROS를 측정할 샘플 수만큼 에펜도프 튜브를 준비하신 다음, 각각 HBSS 1ml을 분주해 놓고 로딩 직전에 DCFDA를 희석시켜서 사용하시면 신속하게 실험을 수행할 수가 있습니다.