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지식나눔

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SPA (scintillation proximity assay) 질문입니다.

2006-09-06 org.kosen.entty.User@78b2e352 구선영(sykoo)
  • 1
안녕하세요? 저는 SPA방법으로 receptor binding assay를 하고 있습니다. 자세히 말씀드리자면, receptor에 약물이 binding하는 정도를 측정하는 실험이구요, copper-chelate PVT bead와 His-tagged protein, 3H-labeled compound를 사용합니다. 실험과정은 먼저 unlabeled test compound, labeled reference compound, protein을 차례로 넣고 1시간정도 상온에서 orbital shaker로 섞어줍니다. 그 다음, PVT bead를 넣고 1시간 더 섞어준 다음 TopCount로 cpm값을 읽습니다. 여기서 문의드릴 내용은 실험이 되다 안되다 하는 것입니다. 실험이 된다는 기준은 단백질 유무에 따른 signal이 5배이상의 차이를 보이느냐와 대조화합물의 binding activity값이 일정하게 나오느냐입니다. 이전에는 일정하게 값이 나오는 것으로 확신했는데, 최근에는 signal이 들쭉날쭉나오거나 activity 자체가 나오지 않기도 합니다. 아마도 assay system이 불안정한 것 같은데, 어디에 문제가 있는 것인지 ... buffer를 새로 만들어 보고, 매번 실험과정을 동일하게 한다고 해도 실험이 될 때, 안 될 때를 제가 control할 수가 없습니다. 동일한 단백질로 다른 assay를 하면 문제가 없는 걸로 봐서 단백질 문제는 아닐 것 같구요... SPA가 워낙 간단한 실험이라고들 하는데, 저는 뭘 잘 못 하고 있는지조차 알 수가 없습니다. trouble-shooting을 찾아봐도 저 같은 case는 없네요.ㅠㅠ 지금은 아예 처음부터 다시 set-up하려고 하고 있습니다. 도움 주실 분 계시면 디스커션 및 지도 바랍니다. 끝까지 읽어 주셔서 감사합니다.
  • SPA
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답변 1
  • 답변

    전주홍님의 답변

    2006-09-07
    • 0
    일단 noise signal level은 일정한지요? 그리고 receptor가 얼마나 homogenous하며 storage동안이나 기타 실험 조건에서 얼마나 stable하게 존재하는지 궁금하네요... receptor의 불안정성 때문에 ligand (drug) binding에 문제가 생기는 것은 아닌지요... 물론 다른 assay에서 별 문제가 없었다고 하셨지만 정확히 무엇을 분석했는지 잘 몰라서 생기는 의문점입니다. 실험 내용 또는 분석 대상이 전혀 다르다면 receptor 자체의 문제는 배제하기 힘든 것이 아닐까 합니다. 왜냐하면 또 한가지는 scintillation proximity assay 방법말고 Gold standard 방법으로 정말 실험에 사용되는 compound가 receptor에 결합하는지를 cross-check을 해 보셨는지 궁금합니다. 그래야 단백질의 문제를 완전히 배제할 수 있지 않을까요? >안녕하세요? >저는 SPA방법으로 receptor binding assay를 하고 있습니다. >자세히 말씀드리자면, receptor에 약물이 binding하는 정도를 측정하는 실험이구요, >copper-chelate PVT bead와 His-tagged protein, 3H-labeled compound를 사용합니다. > >실험과정은 먼저 >unlabeled test compound, labeled reference compound, protein을 차례로 넣고 1시간정도 >상온에서 orbital shaker로 섞어줍니다. >그 다음, PVT bead를 넣고 1시간 더 섞어준 다음 TopCount로 cpm값을 읽습니다. > >여기서 문의드릴 내용은 실험이 되다 안되다 하는 것입니다. >실험이 된다는 기준은 단백질 유무에 따른 signal이 5배이상의 차이를 보이느냐와 >대조화합물의 binding activity값이 일정하게 나오느냐입니다. >이전에는 일정하게 값이 나오는 것으로 확신했는데, >최근에는 signal이 들쭉날쭉나오거나 activity 자체가 나오지 않기도 합니다. > >아마도 assay system이 불안정한 것 같은데, 어디에 문제가 있는 것인지 ... >buffer를 새로 만들어 보고, 매번 실험과정을 동일하게 한다고 해도 >실험이 될 때, 안 될 때를 제가 control할 수가 없습니다. >동일한 단백질로 다른 assay를 하면 문제가 없는 걸로 봐서 >단백질 문제는 아닐 것 같구요... >SPA가 워낙 간단한 실험이라고들 하는데, >저는 뭘 잘 못 하고 있는지조차 알 수가 없습니다. >trouble-shooting을 찾아봐도 저 같은 case는 없네요.ㅠㅠ >지금은 아예 처음부터 다시 set-up하려고 하고 있습니다. > >도움 주실 분 계시면 디스커션 및 지도 바랍니다. >끝까지 읽어 주셔서 감사합니다.
    답변수정
    일단 noise signal level은 일정한지요? 그리고 receptor가 얼마나 homogenous하며 storage동안이나 기타 실험 조건에서 얼마나 stable하게 존재하는지 궁금하네요... receptor의 불안정성 때문에 ligand (drug) binding에 문제가 생기는 것은 아닌지요... 물론 다른 assay에서 별 문제가 없었다고 하셨지만 정확히 무엇을 분석했는지 잘 몰라서 생기는 의문점입니다. 실험 내용 또는 분석 대상이 전혀 다르다면 receptor 자체의 문제는 배제하기 힘든 것이 아닐까 합니다. 왜냐하면 또 한가지는 scintillation proximity assay 방법말고 Gold standard 방법으로 정말 실험에 사용되는 compound가 receptor에 결합하는지를 cross-check을 해 보셨는지 궁금합니다. 그래야 단백질의 문제를 완전히 배제할 수 있지 않을까요? >안녕하세요? >저는 SPA방법으로 receptor binding assay를 하고 있습니다. >자세히 말씀드리자면, receptor에 약물이 binding하는 정도를 측정하는 실험이구요, >copper-chelate PVT bead와 His-tagged protein, 3H-labeled compound를 사용합니다. > >실험과정은 먼저 >unlabeled test compound, labeled reference compound, protein을 차례로 넣고 1시간정도 >상온에서 orbital shaker로 섞어줍니다. >그 다음, PVT bead를 넣고 1시간 더 섞어준 다음 TopCount로 cpm값을 읽습니다. > >여기서 문의드릴 내용은 실험이 되다 안되다 하는 것입니다. >실험이 된다는 기준은 단백질 유무에 따른 signal이 5배이상의 차이를 보이느냐와 >대조화합물의 binding activity값이 일정하게 나오느냐입니다. >이전에는 일정하게 값이 나오는 것으로 확신했는데, >최근에는 signal이 들쭉날쭉나오거나 activity 자체가 나오지 않기도 합니다. > >아마도 assay system이 불안정한 것 같은데, 어디에 문제가 있는 것인지 ... >buffer를 새로 만들어 보고, 매번 실험과정을 동일하게 한다고 해도 >실험이 될 때, 안 될 때를 제가 control할 수가 없습니다. >동일한 단백질로 다른 assay를 하면 문제가 없는 걸로 봐서 >단백질 문제는 아닐 것 같구요... >SPA가 워낙 간단한 실험이라고들 하는데, >저는 뭘 잘 못 하고 있는지조차 알 수가 없습니다. >trouble-shooting을 찾아봐도 저 같은 case는 없네요.ㅠㅠ >지금은 아예 처음부터 다시 set-up하려고 하고 있습니다. > >도움 주실 분 계시면 디스커션 및 지도 바랍니다. >끝까지 읽어 주셔서 감사합니다.
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