KOSEN 한인과학기술자네트워크

>암세포에 특정물질을 처리해서 MTT로 항암효과를 확인해봤을 때, 항암 효과가 꽤 높았습니다.. >이것이 암세포가 apoptosis가 일어난 것인지, necrosis가 일어난 것인지 확인하고 싶은데요.. >그래서 활성산소(ROS)를 측정하고, flow cytometry로 세포주기별 DNA 조성을 알아보려 합니다.. >ROS 측정은 DCFH-DA를 처리하여 fluorometer로 측정해 보았는데, positive control인 apocynin의 수치가 제 sample처리군보다 더 높게 증가하는 것입니다...물론 black well plate를 사용하였도, DCFH-DA는 빛에 노출되지 않도록 조심하였습니다.. >저희 방에서 cell culture는 처음 하는 거라 어디 물어볼 데도 없어서 막막하기만 합니다.. >또 어디서 글을 보니 flow cytomrtry로 ROS를 측정하면, 분포정도까지 알 수 있다고 하던데요.. >그럼 flow cytomrtry로 활성산소와 DNA 조성 모두 측정이 가능하다는 말입니까?? >그리고 flow cytomrtry로 활성산소와 DNA 조성을 측정하는 protocol을 얻을 수 있으면 좋겠습니다.. >또 혹시 대구.경북지역에 flow cytomrtry를 가지고 있는 곳이 어디 있는지 알 수 있을까요?? >제가 각 학교 중앙기기원 사이트를 찾아봐도 그 기계를 가지고 있는 곳을 찾지 못했거든요.. >영대 병원에 있다는 말을 듣긴했는데, 거기 기계를 외부인이 사용할 수 있는 건지도 모르고 해서 이렇게 글을 올립니다.. >많은 도움 부탁드립니다.. > ROS중에서 hydrogen peroxide의 양을 측정하고 싶으시면, 가장 많이 사용되고 있는 dye인 H2DCFDA를 쓰시면 됩니다. 참고로 저는 sigma의 D-6883을 사용합니다. H2DCFDA는 live cell에서 ROS를 측정할 때 사용할 수 있어서, live cell에 H2DCFDA를 처리 한 후에 형광현미경으로 관찰이 가능합니다. 그러나, 세포를 immunocytochemistry를 하기 위해서 membrane에 구멍을 만들어 버리면, 안에 들어 있던 DCF들이 모두 밖으로 빠져나와서 형광 신호가 감지되질 못합니다. 즉, ROS의 측정과 immunocytochemistry를 따로 해야 한다는 얘기죠. 제가 학생들의 수업에 사용했던 PPT (protocol 포함)를 같이 올리니 이걸 보시면, 왜 ROS의 측정과 immunocytochemistry를 따로 해야 하는지에 대해서 아실겁니다. 그리고, H2DCFDA를 이용해서 ROS를 측정하는 가장 일반적인 방법은 FACS를 이용해서 신호를 분석하는 겁니다. 이렇게 하면, 형광신호, 즉, ROS의 증가 정도와 그 분포를 동시에 분석할 수가 있죠. 그런데, FACS분석이 여의치를 않다면 fluorescence reader를 이용해서도 측정이 가능합니다. 이미 알아 보셨겠지만, DCF는 녹색 형광을 발하죠. 그래서, 녹색 형광을 측정할 수 있는 microplate reader가 있다면, 이걸 이용해도 됩니다. 단 이때는 ROS의 분포는 알 수가 없고, 오로지 생성된 전체 ROS의 양만이 측정가능하다는 단점이 있습니다. 이 방법을 사용할때, 세포를 파괴하시면, 위에서 얘기한 것처럼 형광 신호를 검출할 수가 없습니다. well plate에 세포를 키워서 H2DCFDA를 처리 후에 reader로 읽으면 되죠. 어떤 랩에선 균일한 신호의 검출을 위해서 세포를 trypsin으로 처리해서 plate에서 떼어낸 후에 suspension 상태에서 측정을 하기도 합니다. 아무래도 세포란 녀석들이 plate에 아주 균일하게 퍼져서 자라는 것이 아니기 때문에, 신호 검출시에 차이가 발생할 수 있는 여지를 미연에 방지하기 위해서 suspension 상태에서 측정을 해주는 것이 낫죠. 그 밖에, live cell에서 H2DCFDA를 이용한 ROS 측정과 함께 DNA content를 이용한 cell cycle분석을 동시에 할 수도 있습니다. 이때는 live cell의 세포막을 통과할 수 있는 DNA staining dye를 사용해야하죠. http://probes.invitrogen.com/handbook/tables/0381.html 이 주소로 가시면 live cell에 쓸 수 있는 DNA dye들이 나오죠. DCF는 녹색형광이니까, DNA dye는 오렌지 또는 적색 형광의 dye를 사용해야 하고, 또 하나 중요한 것은 excitation/emission 파장이 사용하고자 하는 FACS 기기에서 지원이 되는 지를 반드시 확인하고서 실험을 해야합니다. 일반적으로 FACS는 광원으로 400 nm 대의 레이져를 광원으로 이용하는데, 만약 사용하고자 하는 cell-permeant DNA dye가 그 영역에서는 전혀 excitation이 되지 않는다면 사용할 수가 없죠. 그래서, 보통은 live cell로는 ROS를 측정하고, 따로 fixed cell로는 DNA content (주로 PI를 사용)를 측정합니다. 마지막으로, 측정하고자하는 ROS가 정확히 어떤 것인가에 따라 ROS dye도 구분을 해야합니다. 일반적으로 쓰이는 DCF의 경우에는 주로 H2O2와 반응하고 약하지만 hydroxyl radical과도 반응합니다. 만약 superoxide anion을 측정하고자 한다면 dihydroethidium을 써야 하고, H2O2라도 세포 내의 전체 H2O2가 아니라 mitochondria의 H2O2만을 측정하고자 한다면, MitoSox라는 dye를 써야 합니다. 그럼, 도움이 되었기를 바랍니다.