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Yeast two-hybrid system을 활용한 단백질 상호작용 조절 저분자 물질 탐색 연 구 방 법 1. Yeast two-hybrid system을 위한 plasmid LexA 단백질의 DNA binding domain을 가지는 plasmid는 auxotrophic marker로 HIS3를 그리고 B42의 activation domain이 있는 plasmid에는 TRP1을 auxotrophic marker로 가지고 있다. 일반적인 LexA를 갖는 plasmid는 pLexA/pEG202로 yeast ADH1 promoter를 통해 발현되며 LexA binding domain과 nuclear localization signal을 가지고 있다. 또한 가장 널리 이용되고 있는 B42 domain을 갖는 것은 pB42AD/pJG4-5로서 SV40 nuclear localization signal과 hemagglutinin으로부터 유래된 epitope tag 및 yeast가 galactose에서 성장할 수 있도록 yeast GAL1 promoter를 가지고 있다. 이 GAL1 promoter는 galactose 의존적으로 작용하기 때문에 많은 false positive를 제거하는데 이용된다. 상호 작용의 확인은 LEU2와 lacZ 의 두 개 리포터 유전자를 사용하는데, LEU2 리포터는 yeast genome내에 삽입되어져 있으며 upstream에 LexA binding site를 가지고 있고, lacZ reporter는 URA3 maker를 가지는 2μ plasmid에 위치해 있다. 2. Yeast transformation 1) 시 약 i. Yeast 배지 a. YPD medium; 20g/L Difco peptone 10g/L yeast extract 20g/L agar pH는 5.8로 맞춘다. 멸균한 후 55℃정도로 식힌 후 2%가 되도록 20% dextrose나 glucose stock solution을 넣는다. b. SD medium; 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acid 20g/L agar 100ml 10×Dropout solution pH는 5.8 멸균한 후 55℃정도로 식힌 후 2%가 되도록 dextrose나 glucose를 넣는다. c. 10×Dropout solution; L-Isoleucine (300㎎/L) L-Valine (1500㎎/L) L-Adenine hemisulfate salt (200㎎/L) L-Arginine HCl (200㎎/L) L-Histidine HCl monohydrate (200㎎/L) L-Leucine (1000㎎/L) L-Lysine HCl (300㎎/L) L-Methionine (200㎎/L) L-Phenylalanine (500㎎/L) L-Threonine (2000㎎/L) L-Tryptophan (200㎎/L) L-Tyrosine (300㎎/L) L-Uracil (200㎎/L) Dropout solution은 각 transformation 시에 필요한 배지의 amino acid marker를 제외한 것으로 준비하여 사용한다. d. SD/Gal/Raf/X-gal plates; SD 배지를 준비하여 pH를 맞추지 않고 autoclave한 후 배지가 55℃정도로 식으면 2% galactose, 1% raffinose, 10×BU salt, 20㎍/㎖ X-gal을 넣는다. e. 10×BU salts(pH 7) 70g/L Na2HPO4·7H2O 30g/L NaH2PO4 ⅱ. Herring testes carrier DNA: high-quality carrier DNA; (Nicked calf thymus DNA는 사용하지 않는 것이 좋다.) ⅲ. sterile TE/LiAc ⅳ. TE buffer or sterile, distilled H2O ⅴ. sterile PEG/LiAc solution(40% PEG solution); 10㎖ 일 경우 50% PEG3350 8㎖ , 10×TE buffer(0.1M Tris-Cl, 10mM EDTA, pH7.5) 1㎖, 1M LiAc(pH 7.5) 1㎖ ⅵ. 100% DMSO 2) 실험 방법 ① EGY48[p8op-lacZ]cell을 선택배지에서 250rpm인 30℃ 진탕 배양기에서 24시간 배양한다. ② 자란 세포를 300㎖ 선택배지로 옮겨 OD600 >0.6정도 되도록 250rpm인 30℃ 진 탕 배양기에서 배양한다. ③ 자란 세포를 원심 분리하여 회수한 후 50㎖정도의 TE buffer(pH7.5)나 멸균된 증류수를 넣고 섞는다. ④ 원심분리 한 후 1.5㎖ LiAc/TE buffer를 넣고 잘 섞는다. ⑤ Competent cell 100㎕에 10㎍/㎖의 carrier DNA, 5㎍의 형질 전환을 위한 DNA 를 넣다. 만든 yeast competent cell은 곧바로 사용하는 것이 좋다. ⑥ 여기에 600㎕의 40% PEG4000용액을 섞어 250rpm, 30℃의 진탕 배양기에서 30 분간 배양한다. ⑦ 배양한 반응물에 70㎕ DMSO를 넣고 잘 섞는다. 이때 vortex는 되도록 피한다. ⑧ 반응물을 42℃에서 15분간 heat shock을 가한다 ⑨ 반응액에서 세포만을 얻어 500㎕의 TE buffer(pH7.5)를 넣고 그 중 100㎕를 SD 선택 배지에 분주해 30℃ 배양기에서 3-4일간 배양한다. ⑩ Repoter gene 발현의 확인을 위해서 자란 형질 전환체들을 Uracil, Histidine, Tryptophan, Leucin이 없는 SD/Gal/Raf/X-gal plates로 옮겨 30℃ 배양기에서 3-4일간 배양한다. 3. Beta galactosidase assay(paper disc plate) ① 자란 형질 전환체들을 Uracil/Histidine/Tryptophan/Leucin이 없는 SD/Gal/Raf 액체 배지에서 배양한다. ② SD/Gal/Raf/X-gal plates를 붓기전에 배지에 2% 배양한 세포와 0.001% SDS를 함께 섞어 plate를 만든다. ③ Paper disc에 검색 sample을 40㎕씩 injection한 후 plate 1개 당 9개의 paper disc를 놓는다. ④ 30℃ 배양기에서 24-48시간 동안 배양한다. ⑤ Paper disc 주위에 leucine reporter gene 및 β-galactosidase reporter gene의 expression을 통한 고밀도의 균생육과 푸른색 강도로 interaction의 저해 및 활 성화시키는 물질을 찾아낼 수 있다. ⑥ 시료의 효모에 대한 독성에 의해 paper disc 저해환을 나타낼 수 있으므로 활 성을 나타낸 시료를 대상으로 wild type yeast에 대한 생육억제 활성 실험을 할 필요가 있다. 4. Beta galactosidase assay (Liquid culture assay using ONPG as substrate) 1) 시 약 ⅰ. Z-buffer(pH 7.0) Na2HPO4 7H2O 16.1g/L NaH2PO4 H2O 5.5g/L KC l0.75g/L MgSO4 7H2O 0.246g/L ⅱ. Z-buffer(100ml)+β-mercaptoethanol(0.27ml) ⅲ. 4mg/ml ONPG in Z buffer(사용전에 미리 30℃에서 1-2시간 동안 녹여 둔다) ⅳ. 1M Na2CO3 ⅴ. Liquid nitrogen 2) 실험 방법 ① SD selction medium 에 assay 하고자 하는 cell를 접종하여 30℃에서 overnight 으로 진탕 배양한다. ② 이 overnight culture 2㎖을 8㎖의 SD induction medium으로 옮겨 OD600 = 0.5-0.8이 되도록 배양한다. 이때 검색 sample을 넣고 함께 배양한다. 이 배양액 의 OD600값을 측정한다. ③ 1.5㎖의 cell을 microtube에 넣고 centirfugation하여 얻고 여기서 상층액은 버리 고 1.5㎖의 Z buffer를 넣고 cell을 centrifugation한다. ④ 다시 상층액을 버리고 300㎕의 Z buffer를 넣고 cell을 잘 섞는다. ⑤ 100㎕의 cell을 취해서 새 tube에 넣고 liquid nitrogen에 cell이 들어있는 tube를 30초간 넣었다가 37℃로 옮기기를 2번정도 반복한다. ⑥ 이렇게 cell을 깬후 여기에 β-mercaptoethanol이 들어간 Z buffer를 0.7㎖ 넣고 미리 30℃에서 1-2시간 동안 녹여 두었던 4㎎/㎖ ONPG를 160㎕ 첨가한다. ⑦ 30℃ incubator에서 반응시키고 색이 변할때까지의 시간을 확인한다. ⑧ 반응물의 색이 노란색으로 변하면 1M Na2CO3을 0.4㎖ 넣고 10분간 centrifugation한다. ⑨ 상층액의 OD420값을 측정한다. β-galactosidase unit = 1,000 ×OD420/(t×V×OD600) t = elapsed time(in min) of incubation V = 0.1×concentration factor OD600 = A600 of 1㎖ culture 연 구 실 례 1. 세포 신호전달계 인자인 Hsp90 결합 조절 물질로서 radicicol의 발견 1) Radicicol의 Ras와 Raf-1의 결합 저해 활성 ras proto-oncogene은 mitogenic signal-transduction pathway의 핵심으로 cell cycle이 G0에서 S phase로 진행하는데 중요한 역할을 한다(Feramisco et al., 1984). Raf-1은 serine/threonine kinase로 본 단백질의 N-terminal domain은 Ras가 active 상태에서 직접적으로 결합하는 것으로 알려져 있다(Avruch et al., 1994). 따라서, Ras/Raf 결합에 대한 특이적인 저해제는 Ras가 활성화된 암세포의 증식 신호를 선택적으로 차단할 수 있는 치료제로 개발이 가능할 것이다. 이와 같은 가정하에 Ras/Raf의 protein-protein interaction에 작용할 수 있는 저해제 검색에 yeast two-hybrid system이 사용되었다. 이 system을 이용해 다양한 microbial metabolite를 대상으로 Ras/Raf 결합에 대한 저해제를 paper disc 방법으로 검색한 결과 “radicicol“을 얻을 수 있었다(Ki et al. 1998). Radicicol은 fugus인 Monosporium bonorden으로부터 생성되는 antifungal antibi-otic으로 이미 v-src, v-ras등의 oncogene에 의한 morphological transformation을 억제하는 것으로 알려져 있다(Kwon et al., 1992; Kwon et al., 1997). 본약제에 의한 세포내 Ras/Raf 결합 저해활성은 이같은 세포 활성에 대한 분자 기전 규명에 결정적인 기여를 하였다. 흥미롭게도 radicicol은 Ras/Raf의 결합을 직접적으로 저해하지 않고 Raf와 결합하여 안정성을 증가시키는 Hsp90와 먼저 결합함으로써 Raf의 세포내 분해를 촉진시켜 이 같은 활성을 발휘하는 것이 밝혀졌다(Schulte et al., 1998). 이는 세포신호 증식 전달에 있어 단백질 complex형성의 중요성 및 저분자 유기화합물을 이용하여 이들의 조절이 실제로 가능하다는 것을 보여주는 좋은 예이다. 2) Radicicol의 aminoacyl-tRNA synthetase complex 형성 저해 활성 Aminoacyl-tRNA synthetase는 최소 8개의 다른 polypeptide와 3개의 다른 단백질로 구성된 거대한 복합체로, 이것이 기능을 수행할 수 있는 완전한 complex를 이루기 위해서는 molecular chaperone이 필요할 것으로 추측되어졌다(Rho et al., 1999, Cruiat et al., 1999, Hemmingsen, 1998). Yeast two-hybrid screening을 통하여 glutamyl-prolyl-tRNA synthetase가 molecular chaperone으로 단백질의 folding과 maturation에 관여하는 hsp90과 작용한다는 것을 확인하였다. 이들 두 단백질의 상호작용을 확인한 yeast two-hybrid system에 hsp90의 저해제인 radicicol과 geldanamycin을 처리한 경우 hsp90와 glutamyl-prolyl-tRNA synthetase간의 interaction에 의한 leu2 reporter gene의 발현이 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 반면 histone deacetylase의 활성 저해제인 trichostatin A에 의해서는 두 단백질의 interaction이 저해되지 않아 reporter gene이 발현되었다(Kang et al., 2000). 이것은 거대 단백질 복합체인 aminoacyl-tRNA synthetase내의 단백질들간의 결합 조절에 관여하는 molecular chaperone인 hsp90의 저해를 통해 aminoacyl-tRNA synthetase 복합체 형성도 저해할 수 있다는 것을 보여주는 실례로서 거대 단백질 복합체를 형성하는 구성 단백질간의 상호작용을 저분자 유기화합물을 사용하여 저해 할 수 있다는 가능성을 보여주는 예라고 할 수 있다. 2. Transcription repressor complex의 저해제 탐색 Chromatin구조 내에서 histone은 DNA를 안정화시키고 package하는 역할뿐 아니라 acetylation과 deacetylation을 통해 transcription의 조절에서도 중요한 역할을 한다. 유전자 발현 억제 인자인 histone deacetylase(HDAC)는 RB, mSin3a, N-CoR과 같은 corepressor들과의 상호 작용을 통해 repressor complex의 일부로 chromatin 구조를 이루고 있는 histone 단백질을 탈아세틸화함으로써 유전자의 발현을 억제하는데 관여하는 것으로 알려져 있다(Hassig et al., 1997; Alland et al., 1997; Luo et al., 1998) 한편 HDAC은 유방암의 전이에 관여하는 MTA I(Metastasis associated protein I)이라는 단백질과 상호 작용한다는 것이 밝혀졌는데(Tong et al., 1998) MTA I protein은 사람의 유방암 세포 내에서 고 발현되어져 있는 것으로 알려져 있다(Toh et al., 1994). HDAC 또한 암세포 및 저산소증과 같은 특정 생리조건에서 많은 양이 발현되어지고 있다. 암세포 내에서 HDAC은 corepressor와 함께 tumor suppressor gene들의 발현을 억제하고 있는 것으로 추측되어지고 있는데 MTA I의 경우 특이적으로 유방암 전이시 고 발현되어 HDAC과 결합하므로 이들의 결합을 억제하는 물질을 검색할 경우 RB, mSin3a, N-CoR와 같은 일반적인 repressor들과의 결합을 저해하는 것보다 전이성 암의 치료에 효과적으로 적용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 현재 본 연구실에서는 yeast two-hybrid system을 통하여 HDAC과 MTA I간의 상호 작용을 살펴보고 두 단백질의 결합하는 특정 부위를 확인하였으며 본 결과를 활용하여 HDAC 효소 활성을 저해하지 않으나 HDAC의 단백질 효소 활성에 요구되는 특정 complex의 구조 형성을 파괴함으로써 HDAC complex의 기능을 저해하는 새로운 개념의 저분자 물질 개발에 대한 연구를 수행중이다. 3. IκBβ와 retinoid X receptor의 작용촉진제인 retinoic acid NFκB의 inhibitor인 IκBβ와 상호작용하는 단백질을 yeast two hybrid system을 통하여 screening한 결과 retinoid X receptor를 얻을 수 있었다. IκBβ와 retinoid X receptor가 발현된 yeast two hybrid system에 retinoid X receptor의 ligand인 9-cis-RA를 처리하게 되면 reporter gene의 발현이 증가됨을 관찰할 수 있다(Na et al., 1998). 본 결과는 상술한 radicicol, FK506의 경우와는 달리 저분자 유기화합물에 의해 두 단백질의 상호작용이 증가되는 경우로서 세포내 단백질-단백질간의 상호작용이 분자량 1000이하의 유기화합물이 작용할 수 있는 극히 특정부분의 motif에 의해 조절될 수 있음을 시사한다. 이상의 연구실례에서 살펴보았듯이 효모를 이용한 단백질 상호작용 조절물질 검색은 생체 기능 조절 저분자 물질 개발을 위한 중요한 수단으로 앞으로 그 활용이 더욱 증가할 것이다. 참 고 문 헌 1. Alland, L., Muhle, R., Hou, Jr., H., Potes, J., Chln, L., Schrelber-Agus, N., and DePinho, R. A., Role for N-CoR and hisone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression, Nature, 387: 49-55, 1997 2. Avruch, J., Zhang W., and Kyriakis, J. M., Raf meets Ras: completing the framework of a signal transduction pathway, Trends Biochem. Sci., 19: 279-283, 1994 3. Feramisco, J. R., Gross, M., Kamata, T., Rosenberg, M, and Sweet, R. 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