2006-11-23
org.kosen.entty.User@752f2c5f
박춘매(pichm2)
- 1
mitochondria분리를 하는데요
1 25 gauge syringe로 cell를 깨고
2 1200rpm 5min
3. supernant 12000rpm 15min
4. pellet-mitochondria
이 방법으로 얻었는데 mitochondria에 cytosol성분이 섞였는지는 alpha-tubulin으로 봤는데
mitochondria fraction에도 엄청 빵빵하게 밴드가 뜨거든요.
mitochondria에도 혹시 alpha-tubulin ,이 있어요? 그리고 INJURY받았을때 더 심하거든요, 논문 찾아봐도 alpha-tubulin을 쓴 논문은 없고. 그렇다고 다른 marker를 쓴 논문은 없고 actin같은 경우는 그냥 mitochondria에는 actin이 줄어들었다정도논문이 있구요
한번아니고 혹시 contamination있는가 해서 중간에 1200rpm 으로 5min 씩 여러번 washing 해주었는데 계속 뜨거든요.
만약 alpha-tubulin이 아니면 cytosol의 contamination을 볼려면 뭘 봐야하는지
참고로 mitochondria marker로는 COXIV를 썻는데 나왔어요.
어떻게 하면 될가요?
- mitochondria
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답변 1
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답변
서강식님의 답변
2007-01-15- 0
>mitochondria분리를 하는데요 >1 25 gauge syringe로 cell를 깨고 >2 1200rpm 5min >3. supernant 12000rpm 15min >4. pellet-mitochondria >이 방법으로 얻었는데 mitochondria에 cytosol성분이 섞였는지는 alpha-tubulin으로 봤는데 >mitochondria fraction에도 엄청 빵빵하게 밴드가 뜨거든요. >mitochondria에도 혹시 alpha-tubulin ,이 있어요? 그리고 INJURY받았을때 더 심하거든요, 논문 찾아봐도 alpha-tubulin을 쓴 논문은 없고. 그렇다고 다른 marker를 쓴 논문은 없고 actin같은 경우는 그냥 mitochondria에는 actin이 줄어들었다정도논문이 있구요 >한번아니고 혹시 contamination있는가 해서 중간에 1200rpm 으로 5min 씩 여러번 washing 해주었는데 계속 뜨거든요. >만약 alpha-tubulin이 아니면 cytosol의 contamination을 볼려면 뭘 봐야하는지 >참고로 mitochondria marker로는 COXIV를 ？㎢쨉？나왔어요. >어떻게 하면 될가요? 제 생각에는 세포가 잘 깨지지 않은 것 같네요~ tubulin은 cytosol에 있는 cytoskeleton이죠. 간혹 nucleus에도 있다는 논문도 있지만요. 여하튼 25 gauge syringe로 세포를 homogenization하지 마시고 dounce homogenizer로 해보심이... mitochondria만 얻으실 것이라면 우선 760g로 10분 원심분리해서 핵과 덜 깨진 세포를 가라앉히신 후 상층액을 10,000g로 30분 원심분리해서 그 pellet을 mitochondria fraction으로 쓰시면 됩니다.